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白血病中雌激素受体启动子CpG岛甲基化的实验研究

姚婕  
【摘要】: 目的: 目前启动子甲基化的研究主要集中在单启动子基因调节,多启动子基因调节比单启动子更复杂。雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)有四个启动子,其甲基化研究以往多集中在性激素依赖性肿瘤。本实验利用MSP检测白血病细胞株中ER多个启动子甲基化情况,分析去甲基化剂处理白血病细胞株前后雌激素受体甲基化状态及表达的变化,阐明雌激素受体表观遗传学变化对该受体在白血病中表达的影响;分析白血病患者雌激素受体各启动子甲基化状态及表达,探讨筛选某启动子甲基化成为白血病早期诊断、治疗监测与预后判断分子标志物的可能性。揭示ER启动子甲基化与ER mRNA表达及蛋白表达的关系,为肿瘤的形成与DNA甲基化的关系提供理论依据,从而为肿瘤的治疗提供新的方向。 方法: 1.白血病细胞株HL-60、K562、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1的培养以及5-Aza CdR对细胞株的处理。 2.利用MSP和甲基化产物测序检测白血病细胞株在5-Aza CdR处理前后ERa-A, -B,–C和ERβ、启动子CpG岛甲基化状态。 3.运用RT-PCR检测5-Aza CdR处理前后ERa-A, -B,–C和ERβmRNA的表达。 4.运用Western-blot检测5-Aza CdR处理前后ERa和ERβ蛋白表达的差异。 5.以台盼蓝染色计数实验,3H-TDR插入实验和PI单染色法检测6种白血病细胞株以5′-Aza-Dc去甲基化前后细胞的活力,周期和增殖。 6.以PI单染色法检测6种白血病细胞株以5′-Aza-Dc去甲基化前后细胞凋忘。 7.运用MSP和PT-PCR检测40例白血病患者(未治疗)和10例正常人外周血ERa-A, -B and–C和ERβ启动子CpG岛甲基化和其表达情况。 8.对40例白血病人的预后情况进行一年的追踪。 结果: 1.MSP检测白血病细胞株HL-60、K562、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1ER启动子甲基化显示:在六株白血病细胞株中,ERa-A, -B,–C和ERβ启动子CpG岛处于甲基化状态,但只有ERa-A mRNA表达失活。 2.5-Aza CdR处理HL-60、K562、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1后,ERa-A, -B,–C和ERβ启动子CpG岛发生去甲基化,ERa-A mRNA恢复表达。 3.5-Aza CdR处理白血病细胞株后ERa蛋白表达较处理前ERa蛋白表达显著增强(p0.01),而5-Aza CdR处理白血病细胞株后ERβ蛋白表达较处理前ERβ蛋白表达无明显差异。 4.5-Aza CdR处理白血病细胞株后细胞的活力,周期和增殖较处理前明显下降(p0.01)。 5.5-Aza CdR处理白血病细胞株后细胞的凋亡较处理前明显增加(p0.01)。 6.利用MSP和RT-PCR检测40例白血病患者白细胞ERa-A, -B,–C和ERβ启动子CpG岛甲基化情况和mRNA表达情况,结果ERa-A甲基化阳性率为95%,而正常人白细胞ERa-A却没有发生甲基化。ERa-B,–C和ERβ在白血病患者白细胞和正常人白细胞中均发生甲基化。40例白血病患者白血病细胞ERa-A, -B,–C和ERβmRNA表达情况,结果只有ERa-A表达缺失(95%),而ERa-B,–C和ERβ表达正常。 7.对40例白血病人的预后情况进行一年的追踪后,发现两例ERa-A未甲基化的女性病人对化疗药物敏感,预后良好。 结论: 1.白血病细胞株雌激素受体两个亚型的ERa-A, -B, -C和ERβ启动子CpG岛是处于高甲基化状态,而只有ERa-A mRNA不表达。 2.用5-Aza CdR处理白血病细胞株后,ERa-A, -B,–C和ERβ启动子CpG岛发生去甲基化,ERa-A mRNA出现表达,说明ERa-A启动子甲基化导致ERa-A mRNA表达失活。 3.通过对5-Aza CdR处理白血病细胞株前后ERa和ERβ的蛋白表达分析,结果发现去甲基化后6株白血病细胞ERa蛋白表达均明显增强(p0.01),而ERβ蛋白表达无明显改变。 4.运用台盼蓝染色计数实验,3H-TDR插入实验和PI单染色法分析5-Aza CdR处理血病细胞株前后细胞活力,周期和增殖的改变,发现甲基化后6株白血病细胞细胞活力,周期和增殖明显降低(p0.01)。以PI单染色法分析5-Aza CdR处理血病细胞株前后细胞凋亡的改变,发现甲基化后6株白血病细胞细胞凋亡明显增多(p0.01)。 5.白血病患者(未治疗)外周血标本ERa-A启动子CpG岛发生甲基化为95%,表达缺失95%,而正常人没有发生甲基化且表达正常。ERa-A启动子甲基化有可能成为白血病诊断的潜在的标志物。 6.ERa-A启动子CpG岛发生甲基化还能为白血病人的内分泌治疗方案的选择及其预后判断提供理论依据。


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