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《第三军医大学》 2009年
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ERCC5基因启动子区SNP与晚期结直肠癌铂类药物疗效的关联分析及其功能研究

陈建芳  
【摘要】: 背景与目的 铂类药物被证明能有效治疗进展期结直肠癌,但就肿瘤患者个体而言,对铂类药物的敏感性存在显著个体差异。已知药物敏感性个体差异很大程度上由遗传因素决定,与药物作用机制、药物代谢相关基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)密切相关。核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair,NER)途径是主要的DNA修复途径之一,与铂类药物抵抗关系密切。NER是目前唯一明确的哺乳动物正常细胞针对铂类药物造成的DNA加合物等较大损伤的修复机制。虽然奥沙利铂为基础的化疗方案已成为晚期结直肠癌的一线治疗方案之一,但目前NER修复途径SNP与铂类药物疗效的相关性在结直肠癌中的研究少且各研究之间的结论很不一致,因此筛选出能够预测铂类药物治疗结直肠癌疗效的预测指标意义重大。ERCC5 (Excision repair cross complementation group 5)又称XPG (Xeroderma pigmentosum pomplementary group G),是NER修复途径的关键因子之一。研究表明ERCC5基因在多种肿瘤组织和细胞株中均有表达且其表达水平与铂类药物敏感性相关。 启动子区域含数目众多的转录因子结合位点,因此是基因转录调控的重要区域,越来越多的证据表明启动子区的基因突变如SNP可影响靶基因的转录。有研究提示ERCC5启动子区域的SNP位点可能影响基因的转录或基因功能但缺乏确凿证据。我们通过dbSNP数据库及Ensembl数据库查询ERCC5基因的SNP相关信息,结果显示此基因各个区域均存在多个SNP位点,在5’-UTR区及其上游也有较多的SNP位点;在HapMap数据库中搜索汉族人群中此基因的SNP信息也得到相吻合的结果。因此我们推测由于某些启动子区域SNP的存在,使得基因的表达水平或生物活性呈现个体差异,从而对铂类药物表现出不同的反应性,有必要对ERCC5基因单核苷酸多态性与铂类药物疗效的相关性作深入研究。 为此,本研究以铂类药物为主化疗的晚期结直肠癌患者为研究对象,分析ERCC5基因启动子区域SNP与临床疗效的关系,筛选出与疗效相关的SNP位点进一步鉴定其生物学功能,并研究其对结直肠癌组织ERCC5基因表达的影响,以期探讨单核苷酸多态性、基因表达水平、化疗疗效之间的关系。 方法 1.通过生物信息学方法对国际共享库中ERCC5基因启动子区SNP信息进行数据挖掘,筛选出可能影响基因表达或基因功能的SNP位点。 2.应用PCR-LDR法检测ERCC5基因启动子区域候选SNP位点在以铂类药物为主化疗的中国晚期结直肠癌患者中的分布情况。基因型分布由χ2检验分析是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。通过LDA软件检测连锁不平衡。通过PHASE软件构建和分析单倍型。基因多态性与奥沙利铂化疗疗效的相关性用χ2检验或Fisher精确概率法。用Kaplan-Meier法描绘生存曲线,Log-rank检验比较不同基因型及单倍型患者的无进展生存期(Time to progression,TTP)。应用单变量及多变量Cox比例风险模型评估基因型及各临床因素对TTP的影响。 3.采用PCR定点突变法构建含ERCC5基因两个与疗效相关的SNP位点4种单倍型荧光素酶报告基因载体,通过转染结肠癌细胞株LOVO观察SNP对启动子活性的影响;并合成含-763A、-763G、+25A、+25G等位的寡核苷酸探针,通过EMSA实验观察不同等位探针与核蛋白结合能力的差异,以初步鉴定SNP的功能。 4.采用荧光定量PCR及Western blot方法检测不同基因型结直肠癌组织中ERCC5基因mRNA及蛋白的表达。 结果 1.筛选出6个候选SNP位点-1415CT (rs2094258),-763AG (rs2016073),-413CT (rs943245),+25AG (rs751402),+202CT (rs2296147)及+372CT (rs2296148)进行进一步研究。 2.本研究人群中存在-1415CT、-763AG、+25AG、+202CT及+372CT等5个位点多态,各位点均符合Hardy-Weinberg平衡,而在-413CT位点,未发现遗传多态。 3. 105例患者中,携带-763GG基因型的患者客观缓解率显著高于携带-763AA基因型的患者(60.0% vs. 26.3%,P=0.021)。携带+25AA基因型的患者客观缓解率显著高于携带+25GG基因型的患者(56.3% vs. 27.0%,P=0.042)。类似的,携带-763GG基因型的患者疾病控制率显著高于携带-763AA基因型的患者(86.7% vs. 52.6%,P=0.028)。携带+25AG基因型的患者疾病控制率显著高于携带+25GG基因型的患者(73.1% vs. 51.4%,P=0.035)。在-1415CT,+202CT及+372CT三个位点,未观察到多态性与化疗客观缓解率及疾病控制率相关。 4.连锁不平衡分析发现只有-763AG与+25AG两位点存在连锁不平衡关系(r~2=0.73,D’=0.87),单倍型分析发现105例患者中存在两种主要单倍型:-763G/+25A与-763A/+25G,其中携带-763A/+25G单倍型的患者化疗不敏感(SD+PD)的风险显著高于携带-763G/+25A单倍型的患者(62.5% vs. 29.7%,OR 2.000,95% CI 1.110~3.602,P=0.021)。类似的,携带-763A/+25G单倍型的患者化疗疾病进展(PD)的风险显著高于携带-763G/+25A单倍型的患者(66.7% vs. 25.0%,OR 2.148,95% CI 1.130~4.085,P=0.020)。 5.联合基因型分析发现常见的基因型联合有三种,分别是-763AA+25GG,-763AG+25AG,-763GG+25AA。携带-763GG+25AA基因型的患者化疗客观缓解率(61.5%)高于携带-763AA+25GG基因型的患者(27.3%),差异显著(P=0.044)。携带-763GG+25AA基因型的患者化疗疾病控制率(84.6%)及携带-763AG+25AG基因型的患者(73.3%)均高于携带-763AA+25GG基因型的患者(51.5%),差异显著(分别是P=0.049,P=0.047)。 6. 95例患者总的中位TTP为8个月。含-763AA基因型的患者中位TTP(36/95例,6个月)显著低于含-763AG基因型(48/95例,8个月)及含-763GG基因型(11/95例,10个月)的患者(P=0.009)。同样,含+25GG基因型的患者中位TTP(35/95例,5个月)显著低于含+25AG基因型(48/95例,8个月)及+25AA基因型(12/95例,6个月)的患者(P=0.029)。而-1415CT,+202CT,+372CT位点不同基因型之间中位TTP无显著差异。多变量COX比例风险回归模型分析发现-763AA基因型、+25GG基因型是疾病进展的风险基因型,携带一个或以上风险基因型的患者疾病进展风险显著增加(HR 1.948,95% CI 1.211~3.134,P=0.006)。 7.成功构建了含ERCC5基因-763AG及+25AG两个SNP位点的四种单倍型pGL3-Basic重组质粒。双荧光素酶报告系统显示ERCC5基因-910至+292bp片段具有启动子活性,但不同单倍型片段启动子活性存在差异,-763A/+25G单倍型的荧光素酶相对活性显著高于其余三种单倍型(P0.05)。 8.在-763AG位点,-763A、-763G等位探针均能特异性地与核蛋白结合且二者与核蛋白的结合量存在差异,A等位探针与核蛋白的结合量较多,约为G等位探针的1.5倍。在+25AG位点,+25A等位探针不能与核蛋白特异性结合,+25G等位探针能与核蛋白特异性结合。 9.不同基因型结直肠癌组织中ERCC5 mRNA及蛋白表达均存在差异。ERCC5 mRNA在-763AG+25GG、-763AA+25GG、-763AA+25AG基因型结直肠癌组织的表达显著高于-763GG+25AA基因型(P0.001);而在-763AG+25AG基因型中的表达则显著低于-763GG+25AA基因型(P0.01)。ERCC5蛋白在-763AA+25GG及-763AG+25GG基因型组织的表达显著高于-763GG+25AA基因型(P0.05),而在-763AG+25AG基因型中的表达则显著低于-763GG+25AA基因型(P0.05)。在三种较常见的基因型中,-763AA+25GG基因型组织中ERCC5 mRNA及蛋白的表达均较强,-763GG+25AA次之,而-763AG+25AG最弱(P值均0.05)。 结论 1. ERCC5基因启动子区域SNP位点-763AG及+25AG与中国汉族晚期结直肠癌患者铂类药物化疗疗效相关。 2. ERCC5基因-763A/+25G单倍型能显著增强基因启动子活性。基因型为-763AA+25GG的患者结直肠癌组织中ERCC5 mRNA和蛋白的表达较强。 3. -763A、-763G等位探针之间,+25A、+25G等位探针之间与核蛋白结合能力存在差异。-763AG及+25AG多态可改变与核蛋白的结合活性。 4. -763A等位基因、+25G等位基因可能通过增强与转录因子结合能力,增强基因的转录活性,引起相关基因型患者癌组织中ERCC5的表达增强最终导致对铂类药物反应性差。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R735.3

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【引证文献】
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【二级参考文献】
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相关机构
>新疆医科大学
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相关作者
>袁蕾蕾 >刘莉
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