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《第三军医大学》 2009年
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Lefty在创面修复和瘢痕形成过程中表达的研究

李晓伟  
【摘要】: 一、研究背景: 创面愈合过程中增生性瘢痕的形成是康复医学、整形学、烧伤和创伤等领域亟待解决的医学难题之一。而胚胎皮肤,尤其是早龄胚胎皮肤,伤口愈合迅速且无瘢痕形成,称为胚胎无瘢痕愈合。目前,研究显示众多的细胞因子及其受体参与了创面修复,形成了一个复杂的网络调控系统,共同影响创面愈合的结局,但具体的机制仍不清楚。 在众多的细胞因子中,以转化生长因子β(Tansforming Growth Factor beta, TGF-β)的研究最为深入。研究显示TGF-β,一方面促进胶原的合成,另一方面抑制胶原的降解,在瘢痕形成和胚胎无瘢痕愈合中具有重要的作用。因此,TGF-β被认为是影响创面愈合的重要介导因子之一。 有文献表明:Lefty,一种新型的TGF-β阻断剂,能抑制TGF-β的功能和信号转导,影响成纤维细胞的增殖分化,抑制胶原的合成,促进胶原的降解。根据上述研究,我们推测Lefty可能对瘢痕形成有抑制作用并与胎儿的无瘢痕愈合相关,但其在成人正常皮肤、人胚胎皮肤、增生性瘢痕组织、创面愈合过程中的表达尚未见报道。 二、目的: 为进一步了解Lefty在瘢痕形成中的作用,并明确其是否与胚胎无瘢痕愈合相关,我们对动物模型进行了改良,并采用免疫荧光染色、逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)等技术手段,从蛋白水平和mRNA水平对Lefty在成人正常皮肤、人胚胎皮肤、人增生性瘢痕组织、动物模型中创面瘢痕愈合和胚胎无瘢痕愈合过程中的表达情况进行了观察。 三、方法: 将30只裸鼠随机分成3组,每组10只。第一组为瘢痕动物模型改良组。将传统瘢痕动物模型中人全厚皮片移植的位置改在裸鼠背部的皮下;移植物存活后,用加热的铜柱对其进行深Ⅱ度烧伤;观察创面愈合过程中的瘢痕增生情况。第二组为人胚胎无瘢痕动物模型组。将人胚胎皮肤移植于裸鼠背部皮下;移植物存活后,用加热的铜柱对其进行深Ⅱ度烧伤;观察创面愈合情况。第三组为类似瘢痕增生(Analog of Hypertrophic Scar, AHS)动物模型组。在裸鼠背部直接移植人全厚皮片后,不予任何处理,观察皮片干痂脱落后创面愈合情况。 对瘢痕动物模型改良组和人胚胎无瘢痕动物模型组烧伤前,烧伤后第1、2、3、7、14天,第1、3、6个月的移植物,类似瘢痕增生动物模型组移植后第3个月的移植物进行取材,同时留取成人正常皮肤(10例)、人胚胎皮肤(8例)、人增生性瘢痕组织(15例)标本。通过形态学和组织学观察,免疫荧光染色及RT-PCR等技术,观察各组动物模型中移植物的变化;成人正常皮肤、胚胎皮肤、人增生性瘢痕组织及各模型组标本的组织学表现,Lefty蛋白的表达部位;以各标本中阳性细胞所占比率及图像分析仪所测得各标本RT-PCR产物与内参灰度值的比值做为表达量,对Lefty的表达进行半定量测定,结果用SPSS13.0软件进行统计学分析。 四、结果: 1、动物模型的建立 瘢痕动物模型改良组中10只裸鼠存活9只;移植存活皮片与成人正常皮肤相比,无明显差异;移植物烧伤后1个月后,有8只可见明显瘢痕增生,与人增生性瘢痕组织相比,无明显差异;瘢痕增生于烧伤后第2个月达到高峰,6个月后大部分瘢痕仍高于皮面。人胚胎皮肤无瘢痕动物模型组中10只裸鼠均存活;移植存活皮片与人胚胎皮肤相比,无明显差异;移植物烧伤后6个月内未见明显瘢痕增生。类似瘢痕增生动物模型组中10只裸鼠存活8只;移植皮片干痂脱落后,有6只在移植区域出现类似瘢痕样增生,其组织学表现与人增生性瘢痕组织相比,无明显差异;类似的瘢痕增生于移植后第4个月增生达到高峰,8个月后大部分瘢痕仍高于皮面。 2、成人正常皮肤、人胚胎皮肤、人增生性瘢痕组织中Lefty表达的观察 免疫荧光染色结果:Lefty蛋白的阳性表达分布在成纤维细胞的胞质中,分布不均匀。成人正常皮肤、人胚胎皮肤、人增生性瘢痕组织中Lefty蛋白阳性细胞率分别为15.38%、67.92%、84.48%,经χ2检验,人增生性瘢痕组织中Lefty的表达低于人正常皮肤与人胚胎皮肤(p0.01);人胚胎皮肤中Lefty的表达高于成人正常皮肤(p0.05)。 RT-PCR结果:Lefty在成人正常皮肤、人胚胎皮肤、人增生性瘢痕组织中均有阳性表达。三组标本RT-PCR产物与内参的灰度值之比分别为:0.4961±0.0473、1.2037±0.1261、1.6013±0.1283。经单因素方差分析,人增生性瘢痕组织中Lefty的表达低于人正常皮肤与人胚胎皮肤(p0.05);人胚胎皮肤中Lefty的表达高于成人正常皮肤(p0.05)。 3、动物模型创面修复过程中Lefty表达的观察 免疫荧光染色结果:Lefty蛋白的阳性表达分布在成纤维细胞的胞质中,分布不均匀。瘢痕动物模型改良组中,烧伤前,烧伤后第1、2、3、7、14天,第1、3、6个月的组织中Lefty阳性细胞率分别为:66.67%、67.92%、70.91%、66.04%、60.78%、51.02%、42.22%、19.05%、17.07%,经χ2检验,p0.05,提示各组数据间存在统计学差异。Lefty在烧伤前至烧伤后14天各组标本中的表达与成人正常皮肤中的表达相比,无明显差异(p0.05);烧伤1个月后的表达出现下降(p0.05);之后维持在低水平表达(p0.05)。烧伤3个月后的表达接近人瘢痕组织中的表达(p0.05)。人胚胎无瘢痕动物模型组中,烧伤前,烧伤后第1、2、3、7、14天,第1、3、6个月的组织中Lefty阳性细胞率分别为:79.37%、80.65%、82.54%、79.69%、80.33%、79.66%、78.95%、78.69%、76.67%,经χ2检验,p0.05,提示各组数据间无统计学差异。与人胚胎皮肤相比,各组数据均无明显差异(p0.05),显示Lefty在无瘢痕愈合过程中无明显变化,维持了较高水平表达。 RT-PCR结果:Lefty在两种动物模型的创面修复过程中均有阳性表达。瘢痕动物模型改良组中,烧伤前,烧伤后第1、2、3、7、14天,第1、3、6个月的各组标本RT-PCR产物与内参的灰度值之比分别为: 1.0316±0.0680、1.0510±0.0838、1.0960±0.0764、1.0237±0.1070、0.9410±0.0660、0.7907±0.0807、0.6553±0.0465、0.2949±0.0351、0.2652±0.0511,经单因素方差分析,p0.05,提示Lefty在瘢痕修复过程中,各组数据间差异有统计学意义。Lefty在烧伤前至烧伤后3天各组标本中的表达与成人正常皮肤中的表达相比,无明显差异(p0.05);烧伤后7天移植组织中出现下降(p0.05);之后维持在低水平表达(p0.05)。烧伤后3个月移植组织中表达接近人瘢痕组织中的表达(p0.05)。人胚胎无瘢痕动物模型组中,烧伤前,烧伤后第1、2、3、7、14天,第1、3、6个月的各组标本RT-PCR产物与内参的灰度值之比分别为:1.1058±0.0539、1.1234±0.0545、1.1504±0.0633、1.1095±0.0474、1.1199±0.0775、1.1097±0.0494、1.1020±0.0962、1.0971±0.0678、1.0696±0.0792,经单因素方差分析,p0.05,提示各组数据间无统计学差异。与人胚胎皮肤相比,各组数据均无明显差异(p0.05),显示Lefty在无瘢痕愈合过程中无明显变化,维持了较高水平表达。 五、结论: 1、改良后的瘢痕动物模型移植存活组织与成人正常皮肤无明显差异,动物与皮片的存活率、瘢痕复制率提高,建立周期缩短,瘢痕增生明显,可用于观察创面愈合至瘢痕形成的全过程,是一种较理想的动物模型。 2、Lefty在人增生性瘢痕组织中的表达低于成人正常皮肤与人胚胎皮肤;在人胚胎皮肤中的表达高于成人正常皮肤。该结果提示Lefty的低表达可能是瘢痕形成的原因之一,而其高表达可能与胚胎无瘢痕愈合密切相关。 3、瘢痕动物模型改良组中,成人正常皮肤烧伤后形成明显的,持续的增生。Lefty表达在烧伤后7天mRNA水平降低,烧伤1个月后蛋白表达水平降低,烧伤3个月后移植组织中的表达接近人瘢痕组织中的表达,之后维持在低水平表达;在胚胎无瘢痕愈合动物模型中,胚胎皮肤烧伤后,创面愈合后无瘢痕形成。Lefty在各时相点的表达与人胚胎皮肤相比,无明显差异,始终维持在较高水平。该结果提示Lefty的低表达可能是瘢痕形成的原因之一,而其高表达可能与胚胎无瘢痕愈合过程中密切相关。本课题为Lefty在瘢痕防治中潜在的应用价值及创面修复的研究提供了理论参考。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R622

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