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MDSCs定向分化的调控及其在压力性尿失禁中作用的实验研究

王延洲  
【摘要】: 女性压力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI)是指由于各种原因引起盆底肌肉筋膜组织松驰,膀胱和尿道解剖位置改变及尿道阻力降低,致使排尿自禁功能障碍,从而在腹压突然增高时尿液不自主流出的一种疾病。SUI是临床常见疾病,23%~44%的妇女有尿失禁症状,随人口老年化加重,其发病率会不断升高,不仅严重影响患者的生活质量,而且会加重社会医疗负担。 导致SUI的关键机制主要有两种,尿道固有括约肌缺陷(intrinsic sphincter deficiency,ISD)和膀胱颈支撑功能障碍。ISD是导致女性SUI的重要原因,传统的治疗方法对于ISD所致的SUI的疗效差。从本质上改善ISD的方法是纠正其成肌功能障碍,即恢复ISD所致SUI患者成肌细胞功能。随着组织工程和基因治疗发展及干细胞研究深入,干细胞移植成为肌肉组织损伤修复的重要手段,这也为ISD型压力性尿失禁的治疗带来了希望。 肌源性干细胞(Muscle derived stem cells,MDSCs)是高度未分化的多潜能细胞,在适当条件下,MDSCs可分化为骨骼肌成肌细胞、造血细胞、成骨细胞、成软骨样细胞。研究发现骨骼肌损伤时,骨骼肌干细胞可分化形成肌纤维参与肌损伤修复过程。将MDSCs注入心肌梗死或尿失禁模型大鼠,MDSCs可参与心肌或尿道平滑肌的修复。在人体,已有成功用MDSCs治疗心肌梗死或压力性尿失禁的的研究报道。 目前MDSCs向具体细胞分化的机制尚不完全明确,可能与移植后细胞所处环境中的某些信号有关,不同的微环境可诱导MDSCs向不同的细胞分化,即MDSCs具有组织分化特异性。但是在MDSCs移植治疗骨骼肌损伤的研究中发现,MDSCs除分化为骨骼肌细胞外,在TGF-β等细胞因子的刺激下还可分化为成纤维细胞,导致骨骼肌纤维化,而影响细胞移植的疗效。在MDSCs移植治疗压力性尿失禁的研究中也发现:MDSCs或成纤维细胞移植到中段尿道周围,对尿失禁的治疗效果是相同的,提示:MDSCs移植后可能转分化为成纤维细胞参与尿道修复。 我们推测:肌源性干细胞移植后,局部微环境中的炎症细胞释放TGF-β1,诱导肌源性干细胞成纤维分化,而影响了MDSCs成肌功能。探讨TGF-β1及其信号转导途径与肌源性干细胞成纤维分化之间的联系,对更深入的认识细胞移植治疗在体分化状况,提高细胞移植治疗效果具有重要意义。 本研究以SD大鼠为研究对象,利用酶消化法和密度梯度离心法相结合,分离纯化了MDSCs。利用RNA干扰技术,构建了靶向Smad3基因的慢病毒载体。体外shRNA抑制Smad3表达前后,Real-Time PCR及Western blot检测TGF-β1诱导的成纤维化/成肌分化标志蛋白表达变化;建立SUI大鼠模型,在体移植Smad3-shRNA基因修饰的MDSCs,检测抑制Smad3表达对大鼠尿控功能及MDSCs体内分化情况的影响。主要实验方法及结果如下: 一、MDSCs分离培养及成纤维分化的研究 1.通过胶原酶XI和Dispase酶联合消化分离和preplate差速贴壁技术,可以获得纯度较高的SD大鼠MDSCs,在适宜的培养条件MDSCs增殖活力较好,可稳定传代培养。 2. MDSCs的特征为:①低粘附性、小圆形、折光性强;②免疫表型:Sca-1(+)、CD34(+)、CD45(-)、Desmin(+);③有形成肌管的能力,但较肌卫星细胞弱。利用MDSCs的特征组成的鉴定系统可以作为鉴定MDSCs的可靠方法。 3.MDSCs能在TGF-β1刺激下表达成纤维分化标志蛋白Vimentin,而其成肌分化标志蛋白Desmin则被抑制,且存在明显的时间依赖关系,提示TGF-β1可能通过对MDSCs,即干细胞水平影响,参与了肌损伤修复/纤维化进程。 二、靶向Smad3基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定 1.设计4对siRNA干扰序列,并将其成功连接入pGCSIL-GFP载体,体外实验成功筛选出siRNA的最好靶点,靶点序列为:GGATGAAGTGTGTGTAAAT。 2.成功构建Smad3基因ShRNA慢病毒载体。用其感染MDSCs,感染效率在80%以上,此时Smad3蛋白表达的抑制效率达80%。 三、靶向干扰Smad3对MDSCs定向分化及SUI大鼠尿控功能的影响 1.Smad3基因RNA干扰慢病毒载体转染MDSCs可有效阻断TGF-β1诱导的Vimentin表达升高,Desmin表达下调。说明TGF-β1可能是通过激活Smad3蛋白表达,参与了肌损伤--纤维化的进程,阻断Smad3可能具有抑制MDSCs成纤维分化,维持其成肌特性的作用。 2.MDSCs细胞在体移植实验表明:MDSCs移植可修复替代损伤的括约肌细胞,能显著提高腹压漏尿点压(ALPP),改善尿失禁大鼠的控尿功能。抑制Smad3表达后,MDSCs成肌分化能力增强,显著提高SUI大鼠细胞移植治疗的远期疗效。 总之,本研究通过RNA干扰技术抑制MDSCs中Smad3基因表达,siRNA在有效抑制靶基因表达的同时可以有效降低成纤维化标志蛋白表达,维持成肌分化标志蛋白表达,改善尿失禁大鼠的控尿功能。本研究为更深入探讨TGF-β1及其信号转导途径与MDSCs成纤维化分化之间的联系,了解移植细胞在体分化状况,提高细胞移植治疗效果提供了新的线索。


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