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《第三军医大学》 2009年
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阿萨希毛孢子菌基因多态性及基因分型研究

夏志宽  
【摘要】: 背景与目的 毛孢子菌病(trichosporonosis)是由毛孢子菌属引起的毛发、指(趾)甲、皮肤以及系统性感染的真菌病,其临床表现复杂多样。1970年Watson等报道了世界首例毛孢子菌病,2001年杨蓉娅等报道了国内首例播散性毛孢子菌病,近年来,毛孢子菌病的发病率呈明显上升的趋势,这主要和恶性肿瘤的增加,接受器官移植人群增多,免疫抑制疗法、化学疗法、广谱抗菌素以及侵入性医疗操作的广泛应用等因素有关。 目前,可以引起人类感染的毛孢子菌主要包括以下几种:皮肤毛孢子菌(T.cutaneum)、阿萨希毛孢子菌(T. asahii)、星形毛孢子菌(T. asteroids)、皮瘤毛孢子菌(T. inkin)、黏液样毛孢子菌(T. mucoides)、卵形毛孢子菌(T. ovoides)、T.jirovecii、T. dermatis、T. domesticum、T. montevideense、T. japonicum、T. coremiiforme、T. faecalis和T. loubieri等。其中阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T. asahii)是毛孢子菌病及非念珠菌属真菌血症最主要的病原菌,T. asahii引起的感染可以累及到多个器官,且难以诊断和治疗。随着由T. asahii引起的毛孢子菌病病例的增加,临床医生须对其加以足够的重视,特别是对那些免疫缺陷的宿主,由于可以引起致命性的感染,更应提高警惕。 基因序列多态性是真菌菌株的重要特征,基因多态性研究是微生物流行病学研究的重要方法之一,借此研究可以从基因水平确定菌株间的亲缘关系。微生物分型对于社区和医院感染性疾病的流行病学调查和监测、传播途径的了解和阻断、以及发病机理的研究,都极为重要。而T. asahii基因多态性及基因型的研究对于该菌的流行病学、发病机制以及治疗的研究都有着重要的指导意义。研究表明,毛孢子菌属具有种间的多态性和遗传差异;不同国家、地区来源的T.asahii其IGS1区的基因型不完全相同;从表皮分离与从血液和黏膜等不同部位分离的T.asahii ITS区的基因型也不同;从不同的样本、环境中分离T.asahii的遗传差异以及生物学特性也不尽相同。目前对中国T. asahii菌株种内是否具有多态性和遗传差异尚不清楚。国内临床分离的5株T.asahii分离部位、地域及其引起的感染类型均不相同,而他们是否属于不同基因型以及这些不同与基因型间是否具有一定的相关性,尚无研究报道。限制性片段长度多态性分析(RFLP)方法是近年发展起来的基因检测与分型技术,也是分析生物体基因结构最为经典的方法之一,而目前在T. asahii基因多态性研究中尚未得到应用。 本研究首次应用PCR-RFLP方法对国内临床分离5株T. asahii的ITS及IGS1区是否具有种内基因多态性进行探索性研究,分析ITS及IGS1区在T. asahii种内的进化差异,探讨PCR-RFLP方法在T. asahii种内基因多态性研究中的可行性。同时根据IGS1区基因序列对其进行基因型分析,明确国内5株T. asahii分离株的基因型及分布特点,为进一步探讨国内T. asahii感染引起的毛孢子菌病的流行病学调查和监测、传播途径的了解和阻断、发病机理的研究以及T. asahii菌株间的遗传关系、分布特点,分离部位、地域及菌株的致病性与基因型的关系研究提供一定的理论依据。 研究方法 以国内临床分离5株T. asahii为主要研究对象,1株T. asahii标准株作对照(CBS2479T)。用玻璃珠法分别提取临床分离株及标准对照株的总DNA,特异性引物对其核糖体RNA(rRNA)的ITS和IGS1区域进行PCR扩增,分别用限制性内切酶HinfⅠ、HapⅡ、MboⅠ、AluⅠ、HhaⅠ、NcoⅠ对ITS、IGS1区PCR产物进行酶切,用RFLP方法对酶切结果进行分析。对ITS和IGS1区的PCR产物进行纯化、克隆、测序,并将结果提交到Genbank,获取登录号。用Clustal x软件对测序结果进行多重比对分析,寻找碱基突变位点,根据IGS1序列区,将不同国家来源的不同基因型的T. asahii一起构建系统发生树,对国内临床分离5株T. asahii进行基因型分析。 结果 1.所有菌株ITS、IGS1区均扩增、克隆、测序成功,ITS区长度均为541bp,IGS1区长度均为643bp,ITS区序列完全相同,IGS1区序列部分菌株的碱基发生突变,其中菌株BZP07002在449bp(T C)、561bp(A T)位点处碱基发生突变;BZP07003在129bp(A G)、178bp(C T)、204bp(T C)、223bp(G A)、451bp(A T)位点处碱基发生突变;BZP07004在333bp(A G)位点处碱基发生突变。 2. 6株T. asahii ITS区在同一种限制性内切酶酶切下,酶切结果均无差异。6株T. asahii IGS1区酶切出现3种不同的图谱,其中T. asahii BZP07003经HapⅡ酶切结果与其它5株菌不同,T. asahii BZP07004经HhaⅠ酶切结果与其它5株菌不同,IGS1区在同一种限制性内切酶HinfⅠ、MboⅠ、AluⅠ、NcoⅠ内,6株菌酶切结果无差异。 3. T. asahii BZP07001、BZP07005在系统发生树的同一个分枝中,属于基因型1,BZP07003在另一个分枝中,属于基因型4,T. asahii BZP07002和BZP07004分别独立形成一个分枝,与其它任何基因型均不同,为我们新发现的基因型,分别命名为基因型7和基因型8。 结论 1.国内临床分离的5株T.asahii IGS1区具有种内基因多态性和遗传差异,ITS区目前在国内菌株中未发现基因多态性。在T.asahii菌株中,IGS1区比ITS区差异明显,进化更快。 2. PCR-RFLP分析方法以及限制性内切酶HhaⅠ和HapⅡ可用于T.asahii IGS1区基因多态性的分析研究。 3.国内临床分离5株T.asahii分属4个基因型,其中T. asahii BZP07001、BZP07005属于基因型1;T. asahii BZP07002属于基因型7;T. asahii BZP07003属于基因型4;T. asahii BZP07004属于基因型8。本研究在中国的菌株中首次发现T.asahii基因型4,在国际上首次发现基因型7和基因型8。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R519;R450

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