收藏本站
《第三军医大学》 2009年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

程序性细胞死亡4增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性及机制研究

王伟强  
【摘要】: 前言 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis induced ligand,TRAIL)可选择性地诱导癌细胞凋亡,而对正常细胞无显著毒性作用,从而成为肿瘤治疗的研究热点。然而,许多肿瘤细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡缺乏敏感性,其调控机制仍不明确,这使TRAIL的临床应用受到很大的限制。研究表明,肿瘤细胞对TRAIL的耐受性不仅仅是TRAIL受体的表达不同,更主要的是由于作用于TRAIL受体下游众多调控因子的作用。当然,肿瘤细胞对TRAIL的耐受性并不是一成不变的,化疗药物、RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂可调控TRAIL的敏感性。因此,探讨对TRAIL敏感性的调控因子及机制有助于肿瘤的治疗。 基于TRAIL在肿瘤治疗中的重要作用及其面临的挑战,我们致力于寻求TRAIL的调控因子并探讨其机制。程序性细胞死亡因子4(Prgrammed cell death 4,PDCD4)作为新近发现的一种肿瘤抑制剂,可以抑制肿瘤的发生、进展及转移,并且可以提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。既然PDCD4在肿瘤的发生、治疗及预后中起着重要的作用,那么,PDCD4能否增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性?其调控机制如何?我们将重点放在了FLICE抑制蛋白(FLICE-inhibitory protein,FLIP)上。FLIP是凋亡抑制蛋白,是调控TRAIL诱导的细胞凋亡的重要因子。FLIP蛋白与半光天冬酶-8(Cysteine proteases with aspartate , caspase-8)有高度的结构相似性,能与caspase-8相互竞争而使其不能结合到Fas相关死亡受体包含蛋白(Fas associated DD-containing protein,FADD),从而抑制细胞凋亡。另外,磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase / Ser/Thr protein kinase, PI3K/Akt)途径在调控细胞的增生、存活及迁移的过程中起着重要的作用。研究表明,PDCD4可被Akt磷酸化从而抑制其活性。我们设想PI3K/Akt是PDCD4的上游调控因子。 我们以往的研究发现TRAIL可以诱导胃癌细胞或肝癌细胞的凋亡,并且发现了一些可调控TRAIL敏感性的因子如端粒酶逆转录酶、DNMT1基因及阿司匹林。PDCD4对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的敏感性的影响国内外尚未见文献报道,为此我们观察了PDCD4对TRAIL敏感性的影响,并对FLIP和PI3K/Akt途径在此过程中的作用进行了研究。 材料和方法 1.细胞株和抗体 人胃癌细胞株MKN28、SGC7901、BGC823于含10%标准胎牛血清的RPMI1640培养基,37℃、5%CO2孵箱内培养。可溶性重组人TRAIL购自ProSpect(以色列);羊抗人PDCD4、鼠抗人FLIP、鼠抗人caspase-8及活化的caspase-8(cleaved-caspase-8) (p41/43)、鼠抗人Akt及磷酸化Akt(p-Akt)购自SantaCruz(美国);鼠抗人β-actin、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)包被的羊抗鼠二抗、兔抗羊二抗、羊抗兔二抗购自Boister(中国)。 2.含PDCD4基因质粒构建和转染 pBluescriptR-PDCD4质粒(Invitrogen,美国)经限制性内切酶BamH I、EcoR I双酶切后获得PDCD4 cDNA片段。将PDCD4片段亚克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP(全军烧伤研究所),转染至感受态大肠杆菌DH5α,接种至含30%卡那霉素的LB培养皿中,挑取单个菌落进行扩大培养,提取质粒并经酶切及测序鉴定获得含PDCD4基因的质粒,命名为pIRES2-PDCD4。利用脂质体2000(Invitrogen)转染至胃癌细胞BGC823中。转染细胞经G418筛选3 W,获得表达绿色荧光的单个细胞克隆,进行扩大培养,获得稳定过表达PDCD4的细胞系。 3. PDCD4 RNA干扰 针对PDCD4的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)片段(5’GTGCTTCTG AGTTACTCTA3’)亚克隆至pRNAT-U6.1/Neo载体,经测序鉴定后转染至胃癌细胞MKN28中,经G418筛选后获得干扰PDCD4表达的细胞系。 4. Western Blot 细胞经裂解液裂解30min,低温离心15min,取上清得细胞总蛋白。50μg蛋白加入2×上样缓冲液于100℃变性5min,经SDS-PAGE电泳分离,转移至硝酸纤维素膜上,结合特异性抗体及相应二抗,经增强化学发光剂(enhanced chemilum inescence,ECL)( Bioster,中国)显色,经X光片曝光、显影、定影,图片经BandScan软件进行灰度分析。 5.逆转录多聚酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)细胞总RNA经Trizol(Invitrogen)提取。RT-PCR反应参照RT-PCR试剂盒(Promega,美国)操作说明书进行。β- actin作为内参照,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪(Bio-Rad ,美国)分析。 6.细胞存活率和凋亡率检测 胃癌细胞接种至96孔板,经TRAIL作用后,以0.5mg/ml噻唑兰(Thiazolyl blue,MTT)作用4h,加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)振摇10min,经酶标仪(BioRad,美国)于490nm波长下检测吸光度。细胞存活率为处理组吸光度值除以未处理组吸光度值。细胞核经二脒基苯基吲哚(diamidino-phenyl-indole, DAPI)染色,激光共聚焦显微镜(LSM510,META,德国)观察细胞核形态改变并计数细胞凋亡率。 7.统计学分析 数据以x±SD表示,配对资料进行双尾t检验,P0.05有统计学意义。 结果 1. PDCD4在胃癌细胞系中的表达与TRAIL的敏感性相关我们首先通过RT-PCR方法检测了不同分化程度的胃癌细胞中PDCD4 mRNA的表达结果发现PDCD4mRNA在MKN28细胞中的表达(0.25±0.03)明显高于BGC823细胞中表达(0.12±0.01),P0.05。Western Blot检测发现PDCD4蛋白在MKN28细胞中表达(0.35±0.04)较BGC823细胞中表达(0.09±0.01)明显增高,P0.05。MTT及细胞凋亡分析发现MKN28细胞对TRAIL最敏感,而BGC823细胞对TRAIL最不敏感。 2.过表达PDCD4促进BGC823细胞对TRAIL的敏感性pIRES2-PDCD4转染至BGC823细胞中,经G418筛选后PDCD4蛋白和mRNA表达较未转染组明显增高,P0.01。转染PDCD4后的BGC823细胞对TRAIL敏感性无论从时效性和量效性上均较未转染组明显增强。 3.干扰PDCD4抑制MKN28细胞对TRAIL的敏感性PDCD4 shRNA转染至MKN28细胞后PDCD4表达较未干扰组明显降低,干扰效率为86%。干扰PDCD4的MKN28细胞对TRAIL敏感性较未干扰组明显降低。 4.在TRAIL诱导的细胞凋亡过程中,PDCD4调控FLIP表达为了验证PDCD4对FLIP的调控作用,我们用Western Blot检测了FLIP蛋白及caspase-8的活性,结果表明在过表PDCD4的BGC823细胞中FLIP蛋白表达下降,而caspase-8活性增强。经TRAIL处理后,在过表达PDCD4的BGC823细胞中FLIP蛋白呈逐渐下降趋势,而caspase-8活性逐渐增强,并且细胞对TRAIL敏感性增强。干扰PDCD4后的MKN28细胞FLIP蛋白表达增强,caspase-8活性降低,并且经TRAIL处理后FLIP蛋白不再有下降趋势,caspase-8活性亦不呈现增高趋势,细胞对TRAIL的敏感性降低。 为了探讨PDCD4调控FLIP的机制,我们用RT-PCR方法检测了PDCD4对FLIP mRNA表达的影响,结果发现过表达PDCD4后FLIP mRNA表达下降,而干扰PDCD4后FLIP mRNA表达增高。另外,经蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,PDCD4不再调控FLIP蛋白的表达。这表明PDCD4既调控FLIP的转录又通过调控蛋白酶体来调控FLIP蛋白的降解。 5. PDCD4受PI3K/Akt途径调控 首先,通过对不同胃癌细胞中Akt活性的检测,我们发现Akt活性MKN28细胞中表达最低,而在BGC823细胞中表达最高。通过LY294002抑制Akt活性后,BGC823细胞PDCD4表达增高,FLIP蛋白表达降低,caspase-8活性增强,并且细胞对TRAIL敏感性增强。 结论 1.PDCD4在胃癌细胞中的表达与TRAIL的敏感性相关,PDCD4表达越高,对TRAIL的敏感性越强。 2.过表达PDCD4能增强BGC823细胞对TRAIL的敏感性。 3.干扰PDCD4能抑制MKN28细胞对TRAIL的敏感性。 4.PDCD4在TRAIL诱导的细胞凋亡过程中调控FLIP蛋白,并且这种调控作用既在转录水平,又在转录后水平。 5.PDCD4本身受PI3K/Akt途径的调节。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R735.2

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 马刚;刘江;张浩;董明;郑新宇;尾崎岩太;松桥幸子;郭克建;;程序性细胞死亡因子4在胃癌组织中的表达及临床病理学意义[J];中华肿瘤防治杂志;2006年07期
2 ;Effect of NF-kB,survivin,Bcl-2 and Caspase3 on apoptosis of gastric cancer cells induced by tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand[J];World Journal of Gastroenterology;2004年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 叶新青;陈发龙;覃思繁;;Survivin表达与结肠癌组织分化、TNM分期的关系[J];放射免疫学杂志;2010年02期
2 周伟,王秀问;TRAIL耐药机制与药物干预研究进展[J];国外医学(肿瘤学分册);2005年04期
3 马涛;夏加增;李承龙;;胃癌组织中Survivin基因、COX-2和VEGF表达的相关性研究[J];淮海医药;2009年06期
4 沈新生;张谢夫;陈奎生;薛艳格;;胃腺癌组织中cFLIP mRNA的表达及细胞凋亡检测[J];郑州大学学报(医学版);2011年01期
5 唐晓莹;浦雄勇;;小鼠Bax的基因克隆及其原核表达[J];检验医学与临床;2011年06期
6 李淑莲;赵粤萍;都景芳;刘广超;;阿霉素对HL-60、K562细胞表面DR5表达的影响[J];河南大学学报(医学版);2006年02期
7 徐菲;黄岩;田莹;王树森;肖健;曹亚兵;Saroj Niraula;林桐榆;;重组腺病毒TRAIL基因联合抗EGFR靶向药物对肺癌细胞增殖的影响[J];临床肿瘤学杂志;2007年07期
8 刘烜;王海生;刘淑萍;;Wnt信号转导通路与细胞凋亡[J];内蒙古医学杂志;2011年01期
9 谷景义;朱雪娇;费嘉;;PDCD4基因小干扰RNA的筛选及其对人白血病细胞药物敏感性的研究[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2012年06期
10 张秋;TRAIL与消化系统肿瘤[J];中国现代普通外科进展;2003年03期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王思思;亚毒性微小剂量方法对卡铂耐药性的鉴定、预测及其机制研究[D];吉林大学;2011年
2 郑克彬;PTEN基因重组腺病毒治疗脑胶质瘤的实验研究[D];河北医科大学;2011年
3 刘铮;TRAIL肿瘤生物治疗的可控性研究[D];北京协和医学院;2010年
4 赵华;人可溶性TRAIL重组腺病毒治疗肝癌的实验研究[D];苏州大学;2004年
5 徐玉生;TRAIL与顺铂协同诱导横纹肌肉瘤细胞凋亡的实验研究[D];浙江大学;2005年
6 王绍勇;肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体对人膀胱癌治疗作用的实验研究[D];山东大学;2005年
7 徐波;糖皮质激素对ALL细胞Bim、Puma表达的影响及HA14-1诱导ALL细胞凋亡的途径[D];中国医科大学;2006年
8 王冰;rhKD/APP对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用及机理的研究[D];吉林大学;2006年
9 朱战鹏;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导胶质瘤凋亡的研究[D];吉林大学;2007年
10 周生余;重组人凋亡素2配体Ⅰ期临床及相关实验研究[D];中国协和医科大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王晓虹;PDCD4在食管癌组织中表达的实验研究及临床意义[D];山东大学;2010年
2 王世美;TGF-β1及靶向Smad3基因shRNA慢病毒对大鼠肝细胞系BRL-3A增殖的作用[D];山西医科大学;2011年
3 刘杰;芹菜素与TRAIL合用对HeLa细胞活性氧生成和凋亡的影响[D];南华大学;2011年
4 王文怡;黄连素对人胃癌MGC-803细胞增殖和侵袭转移的影响[D];武汉科技大学;2011年
5 沙杰;芹菜素联合热疗法对舌癌Tca8113细胞抗增殖及诱导凋亡的影响[D];郑州大学;2010年
6 张砚;哈萨克族食管鳞状细胞癌Cyclin D1及Survivin表达研究[D];石河子大学;2011年
7 韩鸿璨;CADPE抗肿瘤作用及对胃癌细胞凋亡的影响[D];浙江大学;2011年
8 李锐莉;CuSO_4L_(51)抑制人胃癌SGC-7901细胞生长及其机制研究[D];郑州大学;2012年
9 周慧明;肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体诱导肝癌细胞凋亡的实验研究[D];浙江大学;2003年
10 梁旭东;凋亡调控基因TRAIL、Caspase-3、Survivin在神经母细胞瘤中的检测及意义[D];郑州大学;2003年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 吕有勇;多基因变异的累积与肿瘤发生发展的关系[J];中华医学杂志;1997年11期
2 李连弟,鲁凤珠,张思维,牧人,孙秀娣,皇甫小梅,孙杰,周有尚,欧阳宁慧,饶克勤,陈育德,孙爱明,薛志福,夏毅;中国恶性肿瘤死亡率20年变化趋势和近期预测分析[J];中华肿瘤杂志;1997年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王晚萍;周云;;重组人p53腺病毒提高胃癌细胞对顺铂敏感性的实验研究[J];实用诊断与治疗杂志;2007年05期
2 王晚萍;周云;;重组人p53腺病毒联合紫杉醇对胃癌细胞的作用[J];医药论坛杂志;2007年08期
3 龚育凡;刘霆;陈选民;张鸽文;冷爱民;彭杰;张桂英;;新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗胃癌的实验研究[J];中国现代医学杂志;2010年08期
4 徐玲;刘静;刘云鹏;曲秀娟;张晔;侯科佐;姜又红;;奥沙利铂对TRAIL诱导胃癌BGC823细胞凋亡的增强作用[J];世界华人消化杂志;2010年21期
5 徐玲;刘静;刘云鹏;曲秀娟;张晔;侯科佐;姜又红;;奥沙利铂通过上调死亡受体表达增强TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的实验研究[J];现代肿瘤医学;2010年11期
6 汤睿;朱正纲;瞿颖;蔡劬;李建芳;刘炳亚;燕敏;林言箴;;线粒体途径在温热化疗诱导胃癌细胞AGS凋亡中的作用[J];上海交通大学学报(医学版);2007年05期
7 王竹君;李玲;申兴彬;孙宝信;胡建功;薛承岩;;CEA mRNA检测诊断胃周围淋巴结癌细胞微转移[J];中国医药导报;2007年23期
8 徐玲;曲秀娟;刘云鹏;刘静;张晔;侯科佐;;奥沙利铂通过抑制PI3K/Akt增强胃癌对TRAIL的敏感性[J];中国医科大学学报;2010年09期
9 周自华;段晓明;贺修胜;王俊;李志昭;;二烯丙基二硫增强胃癌细胞对5-Fu敏感性的研究[J];实用癌症杂志;2008年06期
10 徐玲;曲秀娟;刘云鹏;刘静;侯科佐;张晔;;紫杉醇提高胃癌MGC803细胞对TRAIL的敏感性[J];现代肿瘤医学;2011年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李彦;姜政;;构建EGFP-TRAIL融合表达质粒及表达[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
2 刘振佳;陈晓光;;吉非替尼与紫杉醇合用于HERs高表达胃癌细胞的实验研究[A];全国第十一届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2009年
3 董慧敏;魏蕾;范彪;韩国鸽;张懿敏;王永平;周璇;苏可;;小干扰RNA沉默Rac1表达及其对胃癌细胞SGC-7901迁移和侵袭能力的影响[A];中国病理生理学会微循环专业委员会第十二届学术大会会议指南及论文摘要集[C];2007年
4 朱风尚;陈锡美;王毅军;张霞;;环氧合酶抑制剂罗非昔布逆转胃癌细胞BGC-823内在耐药作用[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
5 熊玉霞;周业江;;PI9和GrB在胃癌细胞表达的生物学意义[A];中国生理学会心血管生理学术研讨会论文集[C];2011年
6 袁伟建;;Survivin及bel-2基因表达在吲哚美辛增敏顺铂抗胃癌细胞中的作用[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
7 王春玉;李彦姝;张红艳;李丰;;PAK4负调控胃癌细胞TGF-β1/Smads信号通路[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
8 李庆明;闵存云;;“胃康宁”对胃癌细胞生长和VEGF及其受体表达作用[A];中国中西医结合学会第七次全国实验医学学术研讨会论文汇编[C];2004年
9 双金权;;NS398对SGC7901胃癌细胞生长及CD44V6、MMP-9基因表达的影响[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
10 张金平;陈香宇;李建生;;全反式维甲酸对胃癌细胞BGC-823作用的研究[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 陆叶清;发现抑制胃癌细胞的重要基因[N];上海科技报;2010年
2 衣晓峰 乔蕤琳 记者 赵宇清;抑制胃癌细胞生长研究有新发现[N];黑龙江日报;2010年
3 记者 衣晓峰 通讯员 乔蕤琳;维生素E衍生物能抑制胃癌细胞生长[N];健康报;2010年
4 王雪飞;黄连素能“诱杀”胃癌细胞[N];健康报;2004年
5 吴一福 苏玉军;白藜芦醇可诱导胃癌细胞脱落凋亡[N];中国医药报;2005年
6 王振岭;抗癌药抑制胃癌细胞生长研究获重要发现[N];中国中医药报;2002年
7 王振岭;我国抑制胃癌细胞生长研究有重要发现[N];中国医药报;2002年
8 王振岭;7种抗癌药体外抑制胃癌细胞的研究有新发现[N];医药经济报;2002年
9 晓理;炒股要有敏感性[N];证券时报;2002年
10 衣晓峰;维生素E琥珀酸酯可抑制肿瘤细胞生长[N];中国医药报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王大广;胃癌信号传导蛋白表达谱筛选和分析及XIAP、CDK6抑制剂对胃癌细胞的影响[D];吉林大学;2011年
2 吴成利;ALDH1A1在胃癌中的表达及对胃癌细胞生物学的作用[D];第二军医大学;2011年
3 王伟强;程序性细胞死亡4增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性及机制研究[D];第三军医大学;2009年
4 连海峰;RNAi抑制NRP2表达对胃癌细胞SGC7901生长及侵袭转移的实验研究[D];重庆医科大学;2010年
5 汪素文;乙酰肝素酶反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的实验研究[D];山东大学;2004年
6 吴燕;RhoC与IQGAP1在调节胃癌细胞迁移、增殖中的相互作用[D];江苏大学;2011年
7 彭楠;高温调节耐药胃癌细胞化疗敏感性的分子机制[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
8 赵林;RNA干扰沉默PDGF-D基因对胃癌细胞SGC-7901影响的实验研究[D];重庆医科大学;2010年
9 郑国华;大蒜素硒预防胃癌及大蒜油白藜芦醇诱导胃癌细胞凋亡机理[D];山东大学;2005年
10 葛杰;RNAi介导沉默IGF-IR抑制胃癌细胞BGC823生长及侵袭转移的体外研究[D];中南大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张汝钢;胃癌细胞caspase-8基因甲基化状态对TRAIL抗癌作用的影响[D];第三军医大学;2003年
2 孙立军;RhoB与泰素协同抗胃癌作用及机制研究[D];第四军医大学;2005年
3 黄靓;ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对胃癌细胞MGC-803中RECK、MMP-9基因表达的影响[D];南华大学;2010年
4 苏艳新;多西他赛联合TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的机制探讨[D];重庆医科大学;2008年
5 叶薇;抑制细胞外信号调节激酶对三氧化二砷诱导胃癌细胞MGC-803凋亡的作用[D];中国医科大学;2005年
6 杨继朋;拉曼光谱研究胃癌细胞及胃癌细胞与药物的相互作用[D];华东师范大学;2005年
7 唐启明;PTK抑制剂staurosporine对胃癌细胞影响的实验研究[D];重庆医科大学;2007年
8 武光;整合素α6和β4与胃癌侵袭性的生物学研究[D];兰州大学;2007年
9 智慧;miR-125b在胃癌细胞耐药中的作用及分子机制[D];南京医科大学;2011年
10 何必立;温郁金对胃癌细胞的抑制作用及其对IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和VEGF表达的影响[D];浙江中医学院;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026