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《第三军医大学》 2010年
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胆管癌67kDa层粘素受体调控Fas配体表达的分子机制研究

段世刚  
【摘要】: 研究背景:Fas配体(FasL)是一种分子量约4万道尔顿的跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子超家族,当其与受体Fas结合后能够启动细胞凋亡。目前,大量研究显示:FasL不但在激活的T淋巴细胞上表达,而且在多种肿瘤细胞中表达,在人胆管癌细胞中,FasL也呈过表达。我们的研究及其它一些研究均显示,当高表达FasL的肿瘤细胞与Fas +的T淋巴细胞共培养时,可诱导Fas +的T淋巴细胞发生凋亡。这些研究结果提示肿瘤细胞的免疫逃逸与肿瘤细胞表达FasL有关。然而,关于肿瘤细胞FasL表达的信号调节及转录调控,目前研究仍不透彻。我们以往的研究显示在人胆管癌细胞中67kDa的层粘素受体( 67kDa laminin receptor,67-kDa LNR)过表达可诱导FasL的表达,但其信号调节及转录调控机制目前不清楚。 67 kDa层粘素受体( 67kDa laminin receptor,67-kDa LNR)广泛存在于上皮细胞、内皮细胞、周围神经细胞、巨噬细胞及大部分肿瘤细胞表面,结合位点为LNβ1链的YIGSR序列。67-kDa LNR的高表达,可使癌细胞与基底膜的黏附力增强,有利于肿瘤的侵袭和转移。67-kDa LNR与LN的结合诱导了一系列跨膜信号传导系统的变化,最近的一项研究发现,层粘连蛋白的信号通路参与了有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK的)级联反应。这些结果提示:67-kDa LNR表达上调可能激活MAPK信号转导通路,且MAPK/ERK1/2被激活后,可将信号传递到细胞核内转录因子,从而增加与DNA的结合,促进和调节有关的基因表达。而肿瘤细胞67-kDa LNR激活MAPK信号转导通路是否可调节肿瘤细胞FasL的表达目前还不清楚。 在T淋巴细胞中,FasL基因表达是受转录因子调控,包括NF-KB,AP-1,c-Myc等。然而,在肿瘤细胞中,FasL的转录调控受哪些转录因子的影响目前仍不清楚。c-Myc是一种原癌基因,与肿瘤的分化和发展密切相关,它和异二聚体Max一起形成转录因子复合体,介导了许多肿瘤生长基因的表达。而且,c-Myc不但可以引起细胞的增殖,且可以诱导凋亡,而其诱导凋亡的作用与Fas和FasL的表达有关,Brunner etal.揭示了c-Myc通过直接与FasL启动子相互作用,诱导活化T细胞FasL表达。在肿瘤细胞中,c-Myc是否可以调控FasL的表达目前还知之甚少。 基于以上研究结果和思路,所以在本实验中,我们主要应用MAPK/ERKkinase(MEK)特异抑制剂PD98059,来观察肿瘤细胞67-kDa LNR能否通过MAPK/ERK1 /2信号通路,影响转录因子c-Myc的活性,从而调控人胆管癌细胞FasL的表达,进而影响Jurkat T细胞的凋亡。 来材料与方法: 1.用RT-PCR和Western-bolt检测PD98059处理组及未处理组人胆管癌细胞(QBC939)中c-Myc、p-c-Myc和FasL的表达。 2.采用脂质体转染法转染c-Myc干扰质粒至人胆管癌细胞,用RT-PCR和Western-bolt检测c-Myc和FasL的表达。 3.构建含FasL启动子及c-Myc结合位点(-127/-121)的FasL启动子的突变体的荧光素酶报告基因质粒,分别与pRL-TK表达质粒一起瞬时转染人胆管癌细胞,检测荧光素酶相对活性,比较PD98059处理组及PD98059未处理组人胆管癌细胞FasL启动子活性的变化情况;比较c-Myc结合位点突变前后的FasL启动子活性变化。 4.染色质免疫共沉淀(ChIP)技术分析p-c-Myc与活体人胆管癌细胞中FasL基因启动子的结合情况。 5.建立人胆管癌细胞与人Jurkat T细胞Transwell?小室旁分泌共培养模型,用TUNEL法检测胆管癌细胞PD98059处理组及PD98059未处理组对Jurkat T细胞凋亡的影响。 结果: 1. PD98059处理组人胆管癌细胞(QBC939细胞)磷酸化c-Myc(p-c-Myc)和FasL的表达均明显降低,而c-Myc未见明显变化;c-Myc干扰组胆管癌细胞c-Myc和FasL的表达均明显降低。 2.构建包含FasL启动子的PGL3- FasL-pro荧光素酶报告质粒并有c-Myc结合位点突变的PGL3- FasL-proM荧光素酶报告质粒,均经酶切及测序鉴定,表明PGL3-FasL-pro和PGL3- FasL-proM荧光素酶报告载体质粒构建成功。 3.运用荧火虫酶活性分析技术证实PD98059处理组人胆管癌细胞(QBC939细胞)荧光素酶活性(FasL基因启动子活性)与对照组相比明显下降;c-Myc干扰组及突变体组荧光素酶活性(FasL基因启动子活性)与对照组相比分别下降约80%和70%。 4.用染色质免疫共沉淀技术证实了在人胆管癌细胞(QBC939细胞)中,p-c-Myc与FasL基因启动子存在结合关系。 5.人胆管癌细胞(QBC939细胞)与Jurkat T细胞共培养后,Jurkat T细胞的凋亡指数明显增加;而PD98059处理人胆管癌细胞(QBC939细胞)后,JurkatT细胞的凋亡指数明显降低。 结论: 1.人胆管癌细胞(QBC939细胞)中,MAPK-ERK是67kDa层粘素受体(67-kDaLNR)诱导FasL的表达进而诱导Jurkat T细胞凋亡的主要信号通路之一。 2.人胆管癌细胞(QBC939细胞)中,67-kDa LNR诱导增强FasL基因启动子的活性有赖于转录因子c-Myc的参与,且可能与MAPK-ERK信号通路的活化后增强c-Myc的磷酸化有关。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.8

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【参考文献】
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