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《第三军医大学》 2009年
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Hedgehog信号通路在低氧肺血管重建中的作用及机制研究

张志远  
【摘要】: 肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的异常增殖与凋亡是低氧肺动脉高压肺血管重建发病的关键环节。在此病理过程中,多种细胞因子、生长因子通过细胞内信号传导途径将细胞外增殖信号传至核内,在核内调节基因表达,启动细胞应激反应。然而在此过程中PASMC的信号转导机制尚未完全阐明。 Hedgehog(Hh)信号通路是与发育相关的重要信号转导途径。在脊椎动物Hedgehog主要有三个成员,包括Shh(Sonic hedgehog)、Ihh(Indian hedgehog)和Dhh(Desert hedgehog)。Patched (Ptc)和Smoothened (Smo)共同介导Hedgehog信号向胞内的传递,在无Hedgehog情况下,Ptc抑制Smo,当Hedgehog与Ptc结合后,则解除了其抑制作用,继而Smo激活转录因子Gli,从而增强或抑制一系列Hh信号靶基因的转录,产生一系列细胞效应。 Hh信号通路在胚胎发育中发挥重要作用,对于胚胎细胞的增殖、分化起着极为关键的调节作用,如果此通路发生突变,会导致多种严重的先天发育缺陷。近年来发现,Hh信号通路在成熟机体的多种生理病理过程中也发挥重要调节作用。Shh缺陷的小鼠肺组织血管结构存在障碍,而Shh过度表达会导致血管形成过度。最近报道,生物机械应力可降低大鼠血管平滑肌Hh信号通路主要分子的表达,对动脉血管重建具有显著影响。因此,本研究使用人原代PASMC培养模型,观察Hh信号通路主要分子在正常及低氧时的表达和活性变化,并通过特异性拮抗剂及激活剂调节此通路的活化水平,观察其对PASMC增殖、凋亡及细胞因子分泌等病理变化的影响,以阐明Hh信号通路在低氧肺血管重建中的作用及机制,从而为低氧肺动脉高压的防治提供理论依据和新的治疗靶点。 方法: 1.购买并培养HPASMC细胞株,RT-PCR检测正常HPASMC中Shh、Ptc-1和Gli-1基因mRNA表达;Western blot法检测以上蛋白表达,免疫荧光法检测Ptc-1与Gli-1蛋白在静息状态下HPASMC的定位。Shh刺激实验观察Hh信号通路的功能。 2. Real-time RT-PCR和Western blot检测低氧条件下HPASMC中Shh与Ptc-1 mRNA与蛋白表达变化,免疫荧光法检测Gli-1细胞定位的变化。 3.不同时相点低氧处理HPASMC, Alamar Blue法和流式细胞仪检测低氧条件下阻断Hh信号通路对HPASMC细胞增殖、凋亡与细胞周期分布的变化。 4. ELISA法检测cyclopamine阻断Hh信号通路对低氧诱导的HPASMC分泌MCP-1及IL-6活性的影响。 5. Alamar Blue法检测维生素D3对低氧诱导的HPASMC增殖的影响。Real-time RT-PCR检测维生素D3对低氧诱导的HPASMC中Gli-1基因mRNA的表达影响,免疫荧光法检测Gli-1蛋白细胞定位的变化。 结果: 1.RT-PCR显示HPASMC有Shh、Ptc-1与Gli-1 mRNA表达,免疫荧光检测显示Ptc-1表达在HPASMC细胞膜,而Gli-1在静息HPASMC的胞浆而非胞核表达;Western blot法均检测到以上蛋白表达。Shh刺激可明显促进HPASMC增殖,并可被Hh通路特异性抑制剂cyclopamine阻断。 2.实时定量RT-PCR与Western blot均显示Shh与Ptc-1的mRNA和蛋白表达在低氧4h后升高,8h达到高峰,12h下降。低氧可诱导Gli-1蛋白的胞核聚集,并可被cyclopamine所阻断。 3.HPASMC经24h静息处理后进行常氧与低氧培养,低氧显著促进细胞增殖,其增殖效应主要发生在低氧4h、8h与12h。cyclopamine可明显抑制此低氧诱导的增殖效应,并可明显增加G0/G1期、减少S期与G2/M期细胞周期分布。Annexin -V染色法流式细胞仪检测显示,与常氧对照比较,低氧刺激后HPASMC凋亡明显减少,而cyclopamine对凋亡具有明显促进作用。 4.常氧对照HPASMC培养基上清中可检测到IL-6活性,但无MCP-1分泌,低氧8h处理后二者活性均明显增高,cyclopamine处理可明显抑制二者分泌。 5.维生素D3可明显抑制低氧诱导的HPASMC Gli-1mRNA的表达和蛋白的核内聚集,同时对低氧诱导的HPASMC的增殖具有明显抑制作用。 结论: 1.正常HPASMC有Hh信号通路主要分子的表达,并对细胞生长具有调节功能。 2.低氧可明显活化HPASMC中Hh信号通路的表达,并经由此通路促进HPASMC增殖、抑制凋亡及调节致炎性细胞因子的分泌,提示Hh通路可能是低氧肺血管重建病变进展的重要分子基础,抑制此通路的活化可能是低氧肺动脉高压等疾病治疗新的靶点。 3.维生素D3可通过抑制Hh信号通路活化对低氧肺血管重建起到治疗作用,具有潜在的临床应用价值。
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