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基于寡核苷酸芯片的地中海贫血特异性DNA甲基化的研究

高天  
【摘要】: 地中海贫血是一组由于血红蛋白的珠蛋白肽链(α、β、γ)的合成抑制、失衡,引起无效造血和溶血性贫血。目前,对于这类疾病尚无有效的治疗方法,只能通过遗传筛查及产前诊断选择性的淘汰地贫患儿以控制这类疾病的发生和传播。传统诊断地中海贫血的方法实验周期长,且只能诊断临床上常见的几种基因缺失或点突变所引起的地中海贫血。因此,迫切需要寻求一种新的具有组织特异性的分子靶标,为地中海贫血的诊断提供新途径。 目前,在应用于这种高度异质性遗传病的各种分子诊断方法中,快速简便的基因芯片技术引人注目。因为,常规的基因和蛋白质组学的已不能满足临床的需要,尤其对于反复妊娠发病的或者轻型的地中海贫血患者而言,传统的分子诊断方法不能检测到基因突变或片段缺失,对于这部分病例,经典的遗传学理论无法解释其发病机制。表观遗传学的进展,为地中海贫血寻求和发现新的更简便、更精确、易于推广的诊断方法,提供了可能。 表观遗传学是与遗传学(genetic)相对应的概念,指的是基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化,如DNA甲基化和染色质构象变化等。从目前的研究来看,X染色体剂量补偿、DNA甲基化、组蛋白密码、基因组印记、表观基因组学和人类表观基因组计划等问题都是表观遗传学研究的内容。有文献报道,在任何时候,细胞内都有处于活化状态的基因和失活状态的基因。在发育过程的不同时期发生不同类型的基因转录。有关地中海贫血在表观遗传学甲基化修饰的研究虽有报道,但既不系统又未起到指导临床诊断作用。随着DNA甲基化检测技术的发展和完善,通过寻找受甲基化调控的新位点来诊断和治疗疾病已经逐渐成为相关肿瘤和遗传病的分子诊断和治疗的手段之一。文献报道,在珠蛋白基因转录、发育调控过程中,DNA甲基化起着关键作用。以分子杂交为基础的微阵列技术应用于DNA甲基化检测中,这种方法是基于杂交的寡核苷酸微阵列,是一种在基因组中寻找新位点的方法。通过这种高通量的方法,我们可以找到基因启动子区高度甲基化的基因位点。目前为止,通过微阵列芯片技术检测单基因遗传病地中海贫血鲜有报道。受此启发,本研究拟通过DMH甲基化芯片技术分析地中海贫血中相关分子的表观遗传学甲基化修饰规律和特点,以期能寻求和发现新的诊断地中海贫血的方法,提高地中海贫血的早期诊断率和筛查准确率,为临床早期筛查和诊断地中海贫血胎儿开拓新途径。 本课题由三部分组成,即建立DNA甲基化芯片平台;应用已成熟的基因表达谱芯片进一步筛选基因组地中海贫血新的位点,利用甲基化特异PCR(MSP)验证芯片结果并探讨甲基化差异位点与地中海贫血相关性;通过Sequenom甲基化质谱测序平台对IGSF4基因启动子区测序,观察IGSF4基因在地中海贫血中的甲基化状态,并探讨其与地中海贫血发病机制的关系。 主要结果如下: 1. DNA甲基化芯片模型建立, DNA甲基化芯片数据处理系统完成。 2.通过DMH芯片及其MAS系统的功能分类共发现11条与血液病及遗传病直接相关的有甲基化变化基因,分别为CBFB、HDAC3、IL12A、PLAT、RTKN、RAD52、PTGS1、DGUOK、MRE11A和THRA(ratio2.0)。 3.基因LARP2、HDAC3、THRA在β-地中海贫血中呈高度甲基化状态(ratio2.0),提示LARP2、HDAC3、THRA的高度甲基化可能成为表观遗传学上调控β-珠蛋白的机制之一。 4.经MassARRAY甲基化质谱测序方法对23例地中海贫血和5例正常对照血样对比分析,结果显示,被检测的IGSF4启动子区12个CpG位点在地中海贫血中相对于正常外周血甲基化程度明显增高,呈高度甲基化状态(P0.01),提示IGSF4基因的高度甲基化可能成为导致地中海贫血的机制之一。 5.表达谱芯片数据分析结果显示表达上调基因共有159个,下调基因共有92个。通过MAS系统分析得到与IGSF4途径相关的基因位点CSF1、CSF2、TPO、HBB、HBD、HBA和CBLC与正常外周血相比呈表达下调(ratio0.50); CD45、AZU1和IL1B呈表达上调(ratio2.0),提示与珠蛋白相关的基因通过表达量不同相互作用调控珠蛋白的生成和表达。 6. IGSF4基因实时定量PCR (Real-time PCR)验证结果显示,与正常外周血比,该基因在地中海贫血中呈低表达,且有显著性差异(ratio=0.18,ratio0.50),提示IGSF4基因在地中海贫血中相对于正常外周血而言表达下调。


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