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《第三军医大学》 2010年
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激活瞬时受体电位香草醛亚家族1抗动脉粥样硬化机制研究

马丽群  
【摘要】: 背景和目的: 动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)引起的心脑血管病是全球引起死亡的首要原因。目前认为AS是一种与脂质代谢紊乱相关的全身血管的慢性炎症性疾病,基本的病理生理过程主要是内皮细胞的受损以及血液单核-巨噬细胞、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在血管壁的沉积形成泡沫细胞,尤其在形成的晚期,主要是VSMC起作用。在内源性配体氧化低密度脂蛋白(oxidized-LDL,ox-LDL)的刺激下,VSMC内胆固醇不断增加转化为泡沫细胞,泡沫细胞凋亡释放出炎性物质进一步加重动脉粥样硬化炎性病灶的发生和发展。细胞泡沫化的核心是细胞内胆固醇动态平衡发生紊乱,涉及细胞对胆固醇的摄取和转出异常,目前研究证实在人、大鼠、兔的平滑肌细胞上均存在胆固醇的摄取和转出的一系列受体蛋白,包括低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein recptor,LDLR),低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (LDL receptor–related protein 1,LRP1),ATP结合盒转运体1(ATP-binding cassette transporter type 1,ABCA1),提示平滑肌细胞可能参与了动脉粥样硬化的脂质沉积,但是具体机制目前尚未明确。 既往研究发现,辣椒中的主要辣味成分辣椒素(capsaicin)在减少炎症反应、减少体脂聚集、调节血脂及能量代谢等方面也有积极的作用,这种辣椒素的效应与儿茶酚胺水平升高有关,而是否与辣椒素的受体——瞬时受体电位香草醛亚家族1(Transient receptor potential vanilloid subfamily member 1 ,TRPV1)有关尚不明确。 神经细胞TRPV1通道可被高温、酸性环境、脂质、辣椒素等物质激活,导致以Ca2+为主的跨膜离子流动,进而激活一系列细胞内信号,参与多种伤害性刺激的分辨、整合以及炎症反应。除神经系统外,TRPV1在血管、脂肪、肌肉、肝脏和胰腺均有分布,但对其在心血管和代谢中的作用研究甚少。我们研究发现,辣椒素可激活脂肪细胞TRPV1导致细胞内钙增加,减少脂质在细胞内的堆积,长期辣椒素干预可预防高脂饮食诱导的肥胖。据文献报道,TRPV1在大鼠平滑肌细胞也有表达,其生理意义还不清楚。炎症反应和细胞内胆固醇动态平衡都是动脉粥样硬化形成和发展的重要环节,并且受细胞钙信号的调控,因此,我们推测,激活平滑肌细胞TRPV1可能通过介导细胞内Ca~(2+)变化影响血管炎症反应和细胞内胆固醇动态平衡,从而预防动脉粥样硬化。为了验证上述推测,本研究分为三部分进行。第一部分采用蛋白免疫印迹、RT-PCR、免疫荧光染色及比率荧光成像系统等技术,探讨TRPV1在小鼠主动脉组织和平滑肌细胞表达、分布及其相应功能。第二部分分题一选用原代培养的平滑肌细胞作为研究对象,从离体水平探讨激活TRPV1对平滑肌源性泡沫细胞内脂质蓄积的影响。分题二采用ApoE基因敲除型(ApoE-/-)小鼠作为研究对象,从药物活性水平探讨激活TRPV1后血清中炎症因子(TNF-α,IL-6,hs-CRP)、血脂水平的变化及其对主动脉粥样硬化斑块的影响;分题三选用遗传学技术建立TRPV1ApoE双基因敲除(TRPV1-/-ApoE-/-)小鼠作为研究对象,从基因水平探讨TRPV1基因敲除对主动脉粥样硬化斑块的影响。分题四选用Wistar大鼠作为研究对象,以高脂饮食作为干预手段,研究血管旁脂肪对AS血管重构和功能及TRPV1、AMPK//mTOR信号分子的作用。第三部分采用蛋白免疫印迹、免疫荧光染色等分子生物学技术,探讨激活TRPV1主动脉及平滑肌细胞上相关炎症因子(MCP1、TNF-α、CRP)、粘附分子(P-selectin、VCAM-1、ICAM-1)及脂质代谢相关受体(ABCA1、LRP1、CD36、SR-A)蛋白表达水平及其机制。 材料与方法: 整个研究采用离体实验和在体实验。离体实验主要以原代培养的C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠的主动脉平滑肌细胞作为研究对象。在体实验以ApoE-/-和TRPV1-/-ApoE-/-小鼠、Wistar大鼠作为研究对象,ApoE-/-和TRPV1-/-ApoE-/-小鼠随机分为普食组(ND组),高脂组(HD组),普食加辣椒素组(NCaps组)和高脂加辣椒素组(HCaps组)。Wistar大鼠随机分为普食组(Control组),高脂组(HFD组)。 1.采用蛋白免疫印迹、RT-PCR、免疫荧光染色等分子生物学技术,探讨TRPV1在小鼠主动脉组织和平滑肌细胞表达和分布。 2.选用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠平滑肌细胞作为研究对象,以TRPV1激动剂及其特异性拮抗剂作为药物干预手段,利用比率荧光成像系统检测细胞内[Ca~(2+)]i变化。 3.利用遗传学及分子生物学技术,构建TRPV1-/-APOE-/-双基因敲除小鼠。 4.利用生化分析仪等仪器,采用生化检验技术及放免法检测血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、炎症因子(TNF-α,IL-6,hs-CRP)血糖、胰岛素等生化指标,均严格按照试剂盒说明书进行。 5.以ApoE-/-和TRPV1-/-ApoE-/-小鼠主动脉为研究对象,采用油红O染色技术检测主动脉斑块内脂质沉积的情况,采用天狼猩红染色技术检测主动脉斑块内胶原纤维的表达;采用免疫组化染色技术检测主动脉斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞及脂质代谢相关受体(ABCA1和LRP1)的表达水平。 6.采用Wistar大鼠作为研究对象,采用维多利亚兰染色检测主动脉中膜厚度,采用HE染色观察血管旁脂肪的形态;采用小血管功能仪检测血管活性;采用蛋白免疫印迹法检测主动脉eNOS、TRPV1及AMPK/mTOR增殖信号分子表达。 7.选用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠主动脉及平滑肌细胞作为研究对象,以TRPV1激动剂辣椒素、钙离子载体A23187等药物作为干预手段,采用蛋白免疫印迹法检测主动脉及平滑肌细胞上脂质代谢相关受体(ABCA1和LRP1)、炎症因子(MCP1、TNF-α、CRP)及粘附分子(P-selectin、VCAM-1、ICAM-1)的表达。 结果: 1. TRPV1在主动脉和血管平滑肌细胞上均有表达,TRPV1激动剂可上调TRPV1表达。 2. TRPV1激动剂可呈浓度依赖性地引起的VSMC内游离钙离子的增加,而这种细胞内钙信号变化可被TRPV1拮抗剂或TRPV1-/-所抑制。 3.激活TRPV1可减少平滑肌细胞内脂质蓄积,TRPV1的特异性拮抗剂及TRPV1-/-则不能减少平滑肌细胞内脂质蓄积。 4.激活TRPV1可显著降低高脂喂养ApoE-/-小鼠的血清总胆固醇、甘油三酯水平,而对高脂喂养TRPV1-/-ApoE-/-小鼠血脂水平没有影响。 5.激活TRPV1后可显著降低高脂喂养ApoE-/-小鼠血清hs-CRP、TNF-α和IL-6的水平,对高脂喂养TRPV1-/-ApoE-/-小鼠血清炎症因子水平没有影响。 6.高脂喂养的ApoE-/-小鼠的主动脉根部及腹主动脉的脂质斑块面积较高脂加辣椒素喂养组明显增加,而TRPV1-/-ApoE-/-小鼠两组间没有显著差异。比较ApoE-/-和TRPV1-/-ApoE-/-各组小鼠斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞及胶原纤维成份,结果显示激活TRPV1对斑块内上述成份的表达没有影响。高脂加辣椒素喂养ApoE-/-小鼠与高脂喂养小鼠比较斑块内CD3表达减弱,脂代谢相关受体ABCA1表达增加,而LRP1表达减弱。 7.成功构建了TRPV1-/-ApoE-/-小鼠。与同窝ApoE-/-小鼠相比,TRPV1-/- ApoE-/-小鼠血清中炎症因子(hs-CRP,TNF-α,IL-6)水平升高;血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平升高;TRPV1-/-ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积增加,斑块内CD3表达增强,脂代谢相关受体ABCA1表达减弱,而LRP1表达增强。 8.激活TRPV1可显著上调主动脉和平滑肌细胞ABCA1的表达,而下调LRP1的表达。TRPV1基因敲除蛋白表达水平变化不明显。 9.血管旁脂肪能够明显减少主动脉和肠系膜小动脉内皮依赖性血舒张反应,且高脂诱导后主动脉eNOS的表达下调,主动脉TRPV1功能受损,并伴随着AMPK/mTOR增殖信号通路的改变。 10.激活TRPV1使小鼠主动脉及平滑肌细胞炎症因子(MCP1、TNF-α、CRP)、粘附分子(P-selectin、VCAM-1、ICAM-1)、脂代谢相关受体LRP1表达减弱,而脂代谢相关受体ABCA1表达则显著增强,TRPV1基因敲除则可抑制这种改变。 11.钙离子载体A23187可显著上调平滑肌细胞ABCA1的表达,下调LRP1的表达。TRPV1基因敲除蛋白表达水平变化不明显。 结论: 1. TRPV1在小鼠主动脉和VSMC中均有表达。TRPV1激动剂可呈浓度依赖性地引起的VSMC内游离钙离子的增加。TRPV1激动剂还可上调TRPV1的表达。这说明主动脉和VSMC中存在TRPV1通道的功能性表达。 2.激活TRPV1可降低小鼠血清中的炎症因子、总胆固醇和甘油三酯水平。激活TRPV1还可减少VSMC内脂质聚集及减少高脂饮食诱导的小鼠主动脉中AS斑块的形成。而TRPV1基因敲出后上述各项指标均有不同程度的加重,提示TRPV1参与AS形成的调节。另外高脂诱导大鼠主动脉TRPV1功能受损,并伴随着血管重构及功能障碍。 3.激活TRPV1可上调ABCA1的表达,而下调LRP1的表达,同时可显著下调多种炎症因子,提示钙信号变化可调控LRP1、ABCA1和炎症因子的表达,减少VSMC对胆固醇的摄取并促进胆固醇的转出,抑制炎症反应,减少VSMC泡沫化,预防AS形成。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285

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