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电刺激促进大鼠背根神经节神经元突起生长及机制研究

闫晓东  
【摘要】:周围神经损伤后,轴突变性、炎症反应等逐渐引起神经元变性、坏死;损伤处的雪旺细胞和成纤维细胞等互相作用,形成结缔组织瘢痕,对轴突再生并到达远端靶器官造成阻碍。有效促进周围神经再生,使其在不良因素形成前到达靶器官,是研究和治疗周围神经损伤的新思路之一。 大量体内实验表明电刺激能够有效促进周围神经再生,然而电刺激促进损伤神经修复涉及到细胞内众多分子通路,内在机制十分复杂。我们前期已对电刺激促进体外培养的雪旺细胞分泌神经营养因子的具体机理进行了探讨,但目前对电刺激干预体外培养的神经元及其内在机制还缺乏深入系统的研究。 为此,我们采用体外原代培养的背根神经节神经元,全面筛选有效促进神经元突起生长的电刺激参数,利用此参数电刺激对神经元进行干预,并验证可能参与这些过程的信号通路。本研究为我们深入理解周围神经再生的分子机理提供新的实验依据和理论基础。 目的:筛选能够激活体外原代培养神经元突起再生的电信号参数,从基因、分子、细胞等多层次探讨电信号促进神经元突起再生的信号通路。 方法:(1)使用无血清Neurobasal/B27培养基、低密度体外原代培养培养背根神经节神经元;(2)从双/单相、刺激时间、刺激电压、刺激频率这四个方面对神经元进行电刺激干预,免疫细胞化学染色后,利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量突起长度,筛选有效促进突起生长的电参数;(3)利用激光共聚焦/钙成像技术结合药理学实验观察电刺激作用下神经元胞内钙离子水平的变化,并研究钙离子变化的来源;(4)通过阻断钙离子来源并从分子或mRNA水平,观察电刺激过程中神经元突起再生及神经元表达c-fos、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)与钙离子的相关性;(5)抑制钙-钙调蛋白依赖的蛋白激酶(calcium-CaM-dependent protein kinases,CaMKs)后,观察电刺激作用下神经元中磷酸化的环磷酸腺苷-反应元件结合蛋白(phosphorylated cAMP-responsive element binding protein,pCREB)、c-fos、BDNF表达及突起再生情况。 结果:(1)神经元生长状态良好,纯度达到(92±6)%;(2)在电刺激给予后的1、3、5d这三个时间点观察到,双相电、刺激30min、电压5V、频率10Hz这样的电刺激参数组合,能够有效促进神经突起生长;(3)电刺激作用下,神经元胞内钙离子水平上升,胞内增加的钙离子来源于两个途径:①L、N型电压依赖性钙通道(voltage-dependent calcium channel,L-VDCC、N-VDCC)参与钙离子从胞外向胞内的转运;②三磷酸肌醇受体(IP3 receptor,IP3R)钙库和斯里兰卡肉桂碱受体(ryanodine receptor,RyR)钙库参与胞内钙动员过程;(4)电刺激诱导神经元突起再生加快及增强神经元表达c-fos、BDNF呈现明显的钙依赖性;(5)CaMKs参与电刺激增强神经元中pCREB、c-fos、BDNF的表达;(6)CaMKs参与电刺激促进神经元突起再生。 结论:电刺激作用下,钙离子通过L-VDCC、N-VDCC、IP3R钙库和RyR钙库使神经元胞内钙离子水平上升,胞内增加的钙离子使CaMKs活性增强。CaMKs使CREB磷酸化程度增强。pCREB作用于靶点基因c-fos和BDNF,加强二者转录和翻译,使神经元表达c-fos和BDNF上调,从而促进神经元突起再生。


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