破骨细胞功能相关分子CTSK与ClC-7的临床及基础研究

【摘要】：骨改建是维持骨骼质量、强度以及钙盐平衡必不可少的过程,是破骨细胞介导的骨吸收过程和成骨细胞介导的骨形成过程协同作用的结果。一旦破骨细胞与成骨细胞之间的平衡被打破将会导致骨形态和结构的异常,从而引发一系列骨代谢性疾病。近年来随着细胞生物学及分子遗传学等学科的发展,破骨细胞在遗传性骨病中的作用逐渐被揭开。有研究表明:电压门控氯离子通道7(voltage-gated chloride channel 7 gene,CLCN7)及组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)等十余个基因异常均可引起破骨细胞功能障碍,进而导致遗传性骨硬化性疾病。本研究选择了3例CTSK或CLCN7基因突变所致的遗传性骨病患者进行相关的临床和基础研究,旨在探讨破骨细胞功能相关分子CTSK与ClC-7参与疾病发生的机理,为相关疾病的诊断、预防及治疗提供理论依据。 CTSK基因突变所致致密性成骨不全的临床和基础研究 作为破骨细胞重要的功能分子,CTSK主要参与降解骨有机基质,并可以通过调控破骨细胞凋亡控制破骨细胞数量。CTSK基因突变将导致一类罕见的常染色体隐性遗传性疾病——致密性成骨不全。本研究对1996年以来文献报道的109个家系中的159例致密性成骨不全患者进行了回顾性研究,结果发现:①其中59个家系(涉及104例患者)的基因分析发现了33种不同的CTSK基因突变类型,主要以错义突变为主(69.70%),且位于6号外显子的Arg241和位于7号外显子的Ala277是突变的高发位点;59个家系中除了1个单亲二倍体家系外,携带纯合子突变的家系共44个(74.58%),携带复合杂合子突变的家系为14个(23.73%)。②根据74个家系中97例致密性成骨不全患者的临床表征,本研究发现身材矮小、骨密度增高、颅缝不闭合、颅骨膨隆、频发骨折、下颌角变钝、颌骨发育不良、四肢短小伴指/趾端溶骨是该病最常见的八大表征。③除了错义突变患者指/趾端溶骨和下颌角变钝阳性率较高外(P0.05),其余基因型与表型之间没有明确的关系。根据回顾性研究的结果,我们首次创建了CTSK基因突变数据库(http://www.centralmutations.org/Lsdb.php#CTSK)。 为了进一步研究CTSK功能,探讨CTSK参与疾病发生的机理,本部分研究选择了我科接诊的一例致密性成骨不全患者,在全面检查、基因分析和家系研究的基础上不但证实了该患者的诊断(该患者30年来一直被诊断为骨硬化症),还发现了一对新的CTSK杂合突变位点(p.Trp29X和p.Tyr283Cys)、2个父系p.Tyr283Cys携带者和7个母系p.Trp29X携带者。同时提出颅颌面部特征在致密性成骨不全的鉴别诊断中具有重要意义。 对该患者接受死骨清除术时一并去除的左侧上颌磨牙进行Micro CT扫描和组织学观察,结果发现:牙根周围牙骨质明显增厚(平均厚度为1.30±0.42 mm),牙骨质与周围牙槽骨之间没有明确的界限,根管狭窄伴部分钙化闭锁,但牙本质无明显异常。从而提出CTSK除了在骨代谢方面发挥重要作用外,很可能参与牙骨质的形成并发挥重要作用。同时提出了致密性成骨不全患者拔牙后继发颌骨骨髓炎的一个可能机制:增厚的牙骨质与周围牙槽骨之间没有明确的界限,使得拔牙时容易损伤患牙周围的牙槽骨,增大拔牙创面,造成更多的牙槽骨暴露,从而导致拔牙后继发颌骨骨髓炎的风险增大。 免疫功能相关研究发现该患者外周血总IgE和抑制性T淋巴细胞升高、IL-17A水平和辅助性T淋巴细胞降低。利用白芍总甙胶囊和胸腺肽肠溶胶囊进行免疫调节治疗12周后,各项异常的免疫指标均有不同程度的改善,且右侧上颌骨骨髓炎相关的临床症状逐渐缓解,口内病灶区新生肉芽组织形成并逐渐增大,部分覆盖拔牙创底。该患者外周血IL-17A水平降低不仅预示着CTSK可能在人免疫系统中发挥重要作用,同时也揭示了致密性成骨不全患者拔牙后继发颌骨骨髓炎的又一可能机制:辅助性T淋巴细胞17及其相关细胞因子的匮乏导致致密性成骨不全患者抵抗外源微生物感染的能力减低,从而增加拔牙后颌骨骨髓炎发生的风险。 CLCN7基因突变所致骨硬化症的临床和基础研究 ClC-7作为一种Cl-/H+反向转运体位于破骨细胞的褶皱缘上,通过控制氯离子通透性,调控骨吸收陷窝内的pH值。CLCN7基因突变将导致一组遗传性疾病——骨硬化症,根据其遗传方式、临床特征、疾病的发病年龄以及严重程度,可以分为三型:常染色体隐性遗传性骨硬化症(autosomal recessive osteopetrosis,ARO)、常染色体显性遗传性骨硬化症Ⅱ型(autosomal dominant osteopetrosis typeⅡ,ADOⅡ)、中间型常染色体隐性遗传性骨硬化症(intermediate autosomal recessive osteopetrosis,IARO)。本部分研究选择2例不同类型的CLCN7基因突变导致的骨硬化症患者进行了相关的临床和基础研究。 通过详细的临床研究和CLCN7基因测序分析,证实了病例2为中国首例IARO患者,并发现了一个新的CLCN7纯合突变位点p.Pro470Leu,其母为该位点的杂合携带者。同时发现该患者表现有睾丸及阴茎发育障碍,染色体核型分析发现其Y染色体增大(Yq+)。在以往的研究中,并未见骨硬化症患者表现有生殖系统发育障碍的报道。但CLCN7基因突变、Yq+和男性外生殖器发育障碍之间是否存在相关性还有待于进一步研究。 CLCN7基因测序分析,明确了病例3为CLCN7基因杂合突变(p.Arg286Trp)导致的ADOⅡ。外周血免疫球蛋白、IL-17水平及淋巴细胞亚型分析发现该患者外周血辅助性T淋巴细胞轻度降低,余未见明显异常。ClC-7在人免疫系统中的作用还有待于进一步研究。 本部分研究还发现病例2、3均表现有部分后牙埋藏伴不同程度的牙根发育障碍,于是首次提出ClC-7可能参与牙根发育,且其在牙根发育中的作用存在时空效应和剂量效应的假设。 结论 本研究通过对159例致密性成骨不全患者的文献回顾性研究,得出了致密性成骨不全的临床及分子遗传学特征,并首次创建了CTSK基因突变数据库。通过对3例CTSK或CLCN7基因突变所致的遗传性骨病患者进行相关研究,发现CTSK很可能在人类免疫系统和牙骨质发育方面发挥重要作用,并首次提出ClC-7参与牙根发育,且其在牙根发育中的作用存在时空效应和剂量效应的假设。

【关键词】：破骨细胞 组织蛋白酶K 致密性成骨不全 氯离子通道7 骨硬化症 分子诊断 牙齿
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R596
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