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《第四军医大学》 2011年
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HCVcore蛋白诱发肝脂肪变机制的初步研究

蒋丽娜  
【摘要】:丙型肝炎病毒(hepatitis C vjms,HCv)感染严重影响着全球公共健康,全世界大约有17亿HCv感染者。HCv感染者中,约有80%发展为慢性丙型肝炎,至少有30%的HCv携带者发展成为更严重的肝病,如脂肪肝、肝硬化和肝癌。 HCv属于黄病毒家族中的肝病毒类,其病毒颗粒由一个9.6kh的正性的单链RNA片段包装折叠而成。其基因编码区的阅读框在翻译后可形成一个由30¨00个氦基酸组成的蛋白单体。此蛋白单体在翻译后可黏附于内质网膜上,并在宿主和病毒的蛋白酶的作用下转化为3个结构蛋白(core蛋白、E1、E2)和7个非结构蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。HCv可以分为7个主基因型和多个亚型。蛋白单体还可与细胞表面的特异性蛋白绑定,通过网格蛋白的内吞作用内化,从而启动生命周期。 HCv core蛋白是22kDa的非糖基化蛋白,由靠近5、端的开放读码框编码。作为典型的黄病毒core蛋白,它富含赖氦酸和精氦酸(N端更明显))。它与RNA基因组结合而形成HCv病毒核衣壳。HCv core蛋白的亚细胞定位在细胞质。但当其C端缺夫时,可向核内迁移。这表明HCvcore蛋白可能在HCv致病过程中其到直接而关键的作用。 长期慢性的HCv感染者体内的HCv能够影响肝细胞内脂类代谢,从而导致脂滴在肝脏中的积聚。同时,肝细胞内的脂滴在HCv生命循环中也发挥着非常重要的作用。 HCv诱发脂肪肝、肝硬化最终形成肝癌的机理尚未阐明。普遍认为,HCv通过影响宿主肝细胞的脂代谢,诱发脂肪肝,并逐渐发展为肝硬化、肝癌。HCv诱发脂肪肝很可能与HCv蛋白和细胞脂代谢相关蛋白之间的相互作用有关。其中HCv的core蛋白是重要的致病因素,它涉及到脂滴累积,脂肪基因表达的改变和脂肪相关蛋白的活性。宿主基因表达对病毒生命周期有协助作用。长期肝脂肪变的存在可加速肝硬化和肝癌的进程。 异常的脂代谢能够加速肝病发展,而脂滴分子在HCv复制的过程中叉发挥着关键作用。研究HCv core蛋白诱发脂肪肝的分子机制就显得尤为重要。通过阐明HCv core蛋白诱发脂肪肝的致病机理,控制感染,抑制脂肪肝的形成,并予页防疾病进一步恶化,是目前世界上研究的热点问题。 值得注意的是,HCv core蛋白3a亚型与其他亚型相比,能够更加强烈地诱导肝脏脂肪变的形成,但其基因序列与其他亚型相比,只在数量极少的若干个碱基上有差异。可推测这些差异碱基中具有与肝脂肪变相关的重要序列,但其通过何种机制发挥作用尚不明了。 本研究着眼于HCv core蛋白3a亚型(HCv core 3a)诱发肝脏脂肪变的分子机制。我们构建了携带HA—HCv core 3a基因的重组腺病毒,以携带HA_HCv core 1b基因的重组腺病毒作对照,感染原位灌注分离的小鼠原代肝细胞。在感染24h,48h,72h时间点,分别观察感染HCv core 3a与HCv core 1b和正常肝细胞中脂滴的形成大小,数量等形态学特点。 PPAR_Ⅱ是细胞核激素受体超家族的一员,是正常脂肪细胞分化过程中所必需的。核转录因子PPAR_Ⅱ的主要功能是控制脂肪酸氧化和活化作用。:PPAR_Ⅱ缺乏会导致肝脏中脂肪酸氧化缺陷。因此,我们通过反转录和实时定量PCR技术,检测与脂代谢相关的宿主细胞受体PP.AR一Ⅱ和宿主基因ACCl和FAS酐/mRNA的表达量的变化,从而进一步探究HCv core蛋白诱导肝脏脂肪变的分子机制。 【目的】 1.研究HCv core 3a蛋白在小鼠原代肝细胞中表达时诱导脂滴形成的大小,数量等形态指标; 2.通过实时定量PCR技术检测宿主细胞受体PPAR_Ⅱ,宿主基因ACCl和FAS的mRNA的表达量,研究HCv core蛋白与宿主细胞脂代谢之间的关系。 【方法】 1.构建携带HA_HCv core 3a和HA—HCv core 1b融合基因的重组腺病毒; 2.通过原位灌注分离小鼠原代肝细胞培养,并制作细胞怛片; 3.用携带融合基因HA—HCv core 3a和HA_HCv core 1b的重组腺病毒感染小鼠原代肝细胞; 4.在24h,48h,72h的时间点分别对原代肝细胞进行免疫荧光检测,观察原代肝细胞中脂滴形成的大小,数量等形态学特点; 5.培养小鼠肝细胞系AMLl2,并进行重组腺病毒的感染; 6.反转录受感染细胞中的mRNA为cDNA,进行实时定量PCR检测,以探究HCv core蛋白在肝细胞内诱导脂肪变的分子机制。 【结果】 1.成功构建pAdEasy—HA—HCV core 3a和pAdEasy—HA—HCV core lb重组腺病毒。首先将全基因合成的HCV core 3a(1b)片段连入pCMV-HA载体中,并将HA-HCV core 3a(1b)片段整体转入穿梭质粒pshuttle—CMV中。利用穿梭质粒同源重组获得重组腺病毒质粒,经腺病毒包装和扩增获得高滴度的重组腺病毒。利用western Not技术检测融合蛋白鉴定重组腺病毒包装成功。 2.相对于HCV core lb,感染HCV core 3a重组腺病毒的小鼠原代肝细胞形成的脂滴增大,数量增加。用pAdEasy—HA—HCV core 3a和pAdEasy—HA—HCV core lb重组腺病毒感染小鼠原代肝细胞24h,48h,72h。结果显示,pAdEasy—HA-HCV core3a与pAdEasy—HA-HCV core lb感染相比,前者能够诱导形成体积较大的脂滴,并且脂滴数量明显增加。HCV core lb与正常肝细胞相比也能诱导数量较少的脂肪变。 3.感染pAdEasy—HA—HCV core 3a重组腺病毒的小鼠肝细胞中PPAR—n的mRNA的表达量明显低于pAdEasy—HA—HCV core lb感染的肝细胞以及正常原代肝细胞,同时ACCl表达量有所升高,但FAS的表达量变化不明显。用pAdEasy—HA—HCV core 3a和pAdEasy—HA—HCV core lb分别感染小鼠肝细胞系AMLl2。24h后利用实时定量PCR技术检测PPAR-ct,ACCl和FAS的mRNA含量。发现3a亚型感染与1b亚型感染和正常细胞相比,PPAR-ct的表达量明显降低。而ACCl表达量有所升高,但亚型之间相差不大,而FAS的mRNA的表达量变化不大。 【结论】本研究发现HCV core 3a在细胞水平上诱导肝脏细胞脂肪变的作用比HCV core lb更强。在脂滴大小和数量上部可以明显地看出此趋势,其中HCV core 3a组脂滴大小为HCV core lb组脂滴大小的4~6倍。HCVcore蛋白可能通过降低宿主细胞PPAR-a等相关蛋白的表达量发生作用,诱导脂滴形成,诱发肝脏脂肪变。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R575.5

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