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《第四军医大学》 2000年
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小鼠Endostatin基因的克隆、表达、纯化及其生物学活性的初步研究

屈延  
【摘要】: 脑胶质瘤是严重危害人类健康的常见肿瘤,临床上虽采取积极的治疗 措施,但疗效欠佳,患者死亡率似较高。由于脑胶质瘤的发生和发展必须 依赖大量的血管生成,因此,选择抗胶质瘤血管生成作为治疗靶,从而抑 制胶质瘤的生长,已成为目前治疗胶质瘤一个新的途径。Endostatin是近年 来发现的一种血管生成抑制因子。它具有强烈抑制血管内皮细胞增殖的作 用。可通过与肿瘤血管内皮细胞表面的受体结合,介导其生物学活性,阻 遏胶质瘤的血管形成,从而达到抑制肿瘤生长或促使肿瘤细胞凋亡的目的。 在本研究中,我们首先从小鼠肝脏中提取总RNA,根据mEndostatin cDNA序列合成5′、3′端引物,经RT-PCR扩增出mEndostatin cDNA片段, 以EcoR I和Sal双酶切后,克隆入大肠杆菌克隆载体pUC19载体中,经测 序证实与文献报道的完全一致。再将编码mEndostatin的基因克隆到大肠杆 菌非融合表达载体pDH上,使其受控于PRPL启动子,构建成表达质粒 pDH-Endo,以大肠杆菌DH5α为宿主菌。对工程菌进行温度诱导表达,经 42℃ 5h诱导,工程菌在SDS-PAGE上出现一条新蛋白带,分子量与预期 的一致约为20ku,表达量占菌体总蛋白的12%,以包涵体形式存在。诱导 后的工程菌经裂菌后,所得包涵体先用2%的DOC洗涤2次,再用2M尿 第四军医大学硕士学位论文 素洗涤1次,将洗涤纯化的包涵体溶解于含7M尿素的缓冲液中,dndostatin 纯度可达80%。再经过离子交换层析进一步纯化,最终纯度达到95%以上。 采用透析或稀释复性法对纯化的InEndostatin进行复性处理,并用铜离子催 化自由琉基氧化形成二硫键,得到的复性产物在体外可抑制鸡胚绒毛尿囊 膜(CAM)血管的形成。 抑制胶质瘤血管的生长,是目前治疗胶质瘤的一个方向。本研究克隆 并表达了对血管生成有强烈抑制作用的End。Statin,为利用End。Statin进行 脑胶质瘤基因治疗奠定了实验基础。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:R346

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【参考文献】
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【共引文献】
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