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大鼠睾丸Smad1,Smad2,Smad4和Smad5蛋白的表达与发育变化研究

胡静  
【摘要】: 睾丸是产生精子、维持性征的重要器官,出生后睾丸的发育成 熟、各种细胞的功能分化以及精子发生都受到诸如促性腺激素释 放激素(GnRH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、胰岛素样生长 因子(IGFs)、内皮素(ET)、血管紧张素-Ⅱ(AT-Ⅱ)等多种肽 类因子的调控,其中转化生长因子-β(Transforming growth factor β,TGF-β)超家族即是其中一类重要的睾丸功能局部调节因子。 TGF-β超家族是一个由分泌型的多肽分子,包括TGF-βs、活 化素(Activins)、抑制素(Inhibins)、骨形态形成蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)等构成的细胞因子超家族,在生物 机体及各个器官的发育过程中起重要的作用。TGF-β通过跨膜的 一 1型和*型丝氨酸/苏氨酸激酶受体形成异源受体复合物,并使I 型受体活化,通过Smads通路传递信号。Smads蛋白是近年发现 的TGFo超家族下游一类细胞内信号转导分子,可将信号直接从 细胞膜转导入细胞核内,具有转录活化的作用。Smads编码42—60 kD的蛋白质,由两段高度保守的氢基端和叛基端结构域(MH 和MHZ)和中间富含脯氨酸的高变连接区组成。根据其结构和功 能特性分为三类:第一类受体激活的Smads或通路限制性Smads (Receptor-regulated Smads,R-Smads/Pathway-restricted Smads), 它们的 C端结构域末端含有一个保守的磷酸化位点 SS(V/M)S, 可与1型受体直接作用并被磷酸化。这一类Smads在特定的 TGFB超家族成员介导的信号转导通路中发挥作用,如:BMPs 通过Smadl、Smads和Smads,TGFB和活化素通过SmadZ和 Smad3。第二类为通用的 Smads(Common-mediator Smads, Co.Smads),目前在脊椎动物发现的此类 Smad只有 Smad4。在它 的C端结构域没有磷酸化位点,但它可与其它R-Smads相互作用 并形成稳定的异源三聚体。这种异源三聚体的形成是信号得以转 导所必需的。第三类为抑朱性 Smads(Inhibitory Smads,I-Smads), 包括Smad6和Smad7,它们能够通过阻断R刁mads与受体或 Co.Smads的结合,对Smads的信号转导通路发挥负调控作用。 目前已证实TGF p超家族成员及其受体在辜丸中均有表达, 无论是在分裂期生精细胞,还是在支持细胞、间质细胞都有它们 的存在,且与特殊的生精细胞时相门tage)有关。目前有关 TGF- p超家族成员在精子发生和发育过程中的作用还不清楚,因此从 其信号转导的下游分子Smads的研究入手,进一步弄清其作用机 理和途径尤为重要。本研究分别取自出生后3天、7天、14天、 2 —— 28天和成年的健康雄性S*大鼠睾丸,应用免疫组织化学ABC 法结合葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铰增强技术,检测发育不同阶 段大鼠摹丸Smadl、SmadZ、Smad4和Smads蛋白的定位和发育 变化,并通过图像分析技术对免疫组织化学结果进行定量分析; 应用抗CD 14一抗Smad4及抗SmadZ一抗Smad4双重免疫染色技 术,检测成年大鼠睾丸Smads蛋白的共存现象;应用PAS反应, 显示成年大鼠睾丸生精上皮的不同时相(StageX应用蛋白质兔疫 印迹技术,检测发育不同阶段大鼠睾丸四种Smads蛋白的表达、 变化。 结果表明: 1.Smadl 在出主后14天大鼠睾丸的主精细胞中即可见兔疫 阳性反应,胞核为阴性,支持细胞及间质细胞未见阳性反应; Western-blots则从生后3天起,在发育的各个阶段均有表达。 2.SmadZ从出生后7天起开始表达,免疫阳性产物位于各级 生精细胞的胞质内,支持细胞及间质细胞亦有阳性反应; Western.blots结果从生后3天起,在大鼠睾丸发育的各个阶段均 有表达。 3.Smad4的免疫组化及 Western-blots结果均显示,发育各个 阶段的间质细胞中都有较强的表达,免疫阳性产物位于细胞质内, 而各级生精细胞则无阳性反应。 4.Smads的免疫组化及Western-blots结果显示,仅在28夭 和成年大鼠的间质细胞胞质内有弱的表达,各级生精细胞未见阳 性反应。 5.图像分析及统计结果提示,Smadl、SmadZ、Smad4和Smads 蛋白均随着大鼠宰丸的发育成熟有一个逐渐增多的变化趋势。 3 一 6.PAS反应及免疫组化结果提示,Smad、SmadZ蛋白表达 于各级生精细胞中,其阳性分布趋势与生精小管的生精上皮所处 周期(Circle)的不同时相(Stage)有关。 由此我们的推论是: 1.Smads在促进和维持睾丸组织的发育成熟、各种细胞的


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