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含孔磷酸钙陶瓷为支架基因转染自体细胞成骨能力研究

陈希哲  
【摘要】: 组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理,对病损组织结构和功能的修 复与重建进行研究开发的一门新兴学科。其是继细胞生物学和分子生物学之 后,生命科学发展史上的又一里程碑,标志着人类将走出单纯器官移植领域, 步入组织、器官再造的新时代。 骨是最早在实验室中获得组织工程化的组织之一。组织工程骨修复亟需研 究的内容包括:①能分化为成骨细胞的多能干细胞;②介导多能干细胞游走、 分化、增殖的促生长和分化因子;③可吸收的细胞外基质或称支架以支持干细 胞在骨缺损区的游走及附着;④在整个新骨形成过程中血管网的构成。基于以 上要求,本实验进行了四部分研究: 1 按目前学术界普遍认可的方法进行了大鼠骨髓基质细胞的诱导培养,大鼠 骨髓基质干细胞在含有地塞米松、左旋抗坏血酸、β—磷酸甘油钠等的培养基 中原代培养2周已具明显成骨细胞表型;利用梯密度离心法分离并培养大鼠骨 髓内皮细胞,证实了大鼠骨髓内皮细胞具有W—P小体以及其它内皮细胞共有 的特征。这两种细胞都属有限细胞系,可传代、冻存及复苏。此部分结果为后 续实验打下了基础。 2 进行噬菌粒载体pBK-BMP_2的扩增、提纯及酶切鉴定,并利用脂质体将此穿 梭质粒转染大鼠骨髓基质干细胞。通过免疫组化、原位杂交及Western Blot 印迹杂交检测,从分子水平和蛋白质水平直接或间接地证实经筛选后的细胞克 隆能表达、分泌外源性的BMP_2。 3 应用纤连蛋白对含孔磷酸钙陶瓷进行表面修饰并证实其有利于成骨细胞的 贴附和成骨表型;建立封闭群动物SD大鼠骨组织工程模型并证实其对小型试 材骨修复的研究结果更接近临床;将rhBMP_2转染的自体细胞复合同体骨髓基质 干细胞并种植于含孔磷酸钙陶瓷上,回植原动物皮下或肌肉内均表现明显的异 位成骨能力;这种基因转染自体细胞—陶瓷复合体用于颅骨极量骨缺损的修复 可取得与自体成骨细胞移植相同的效果,间接说明了转染细胞能在体表达BMP_2 并促使未转染的基质干细胞分化为成骨细胞。 4 通过颈总动脉墨汁灌注及透射电镜观察,系统了解并分析自体细胞—陶瓷 陈希哲 下四军医大学博士学位论又 一Z一 要合汁颅g极量骨缺殒修复过程中血管生成与骨形成及陶瓷降解Z问的X系, 1实山向兰ISOtlS提供的含孔磷酸钙陶瓷作为骨组织工程细胞支架有利于血育 和骨的丙十,随时问推移陶瓷本导可以降解;种植的成骨细胞与新上的血管内 皮别胞关系密切,推测其卜必有某些问于引发的信号转导级联效口。 实验设计及技术路线如下图: — — 大鼠左恻殴、温骨骨钮 1 Me***--H_7w~?ri 一J~\ F--s------- WWWk’G一4%:PJ LHerylerx ’tyxtew—“。二{ilZJZtr- 成骨纽胞诱导培养 刀卫sC。rhB卜IP。基因转染 \\/ — ———@p—— 一 细胞一囚瓷 体构鱼 大气颅骨极量骨 修复/、 异位骨形成 回 憾


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