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《第四军医大学》 2001年
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多位点自剪切核酶以乙型肝炎病毒C基因表达抑制作用的研究

李谨革  
【摘要】: 全世界大约有3亿5千万乙型肝炎病毒携带者,这种感染者集 中分布于东南亚、东亚及非洲的撒哈拉地区。HBV的持续存在常可 导致肝硬化以及肝癌。而且对于已感染者,免疫疗法通常无效。 乙型肝炎病毒是一小的DNA病毒,其复制过程需要经过RNA的 生物合成阶段。HBV C基因表达的C蛋白(HBeAg,HBcAg)参与病毒 核衣壳的装配是免疫攻击的靶抗原,因此剪切C区基因mRNA既可 抑制HBV的复制,又可阻断HBcAg的表达。由于锤头型核酶具有分 子小,可序列特异性地切割靶RNA的特点,所以可用它切割HBV C 基因的RNA,阻断HBV基因的复制和表达。本研究用多位点核酶观 察其对细胞内及荷瘤裸鼠中HBV的mRNA的切割作用。 利用我们已经设计并应用过的抗HBV C区基因的核酶的二级结 构,设计将锤状核酶的必需碱基突变。构建突变核酶的体外转录质 粒,体外转录结果表明突变核酶的自剪切体外转录质粒在5’和3’ 顺式核酶发生自剪切后,可正确地将目的核酶释放出来。体外切割 实验表明:多位点核酶可切割靶RNA的不同位点。而突变的核酶对 靶RNA无切割作用。将多位点核酶及突变核酶构建5个不同的真核 表达载体,与含HBV全基因的质粒p1.2Ⅱ共转染HepG2细胞。结果 祭 口 军 召 九 号 丙 亡 住丈 — — 表明,筛选的HepGZ细胞可表达抗HBV的串联型核酶及突变核酶。 不同的载体表达核酶对HBeAg的抑制率不同,PDCTRZA-Rzl23的抑 制率最高,可达 sl引说明聚合酶*转录系统作为启动子可以促使 核酶在细胞内高水平表达。 构建核酶的腺病毒表达载体,转染293细胞,用空斑技术筛选 重组腺病毒。扩增后,感染2.2.15细胞,结果表明,核酶对2.2.15 细胞中的 HBeAq表达有明显抑制,抑制率 8 7.l引免疫组化及激光 共聚焦证实了上述观点。 用重组腺病毒感染荷瘤裸鼠中的含HBV基因的瘤细胞,证实亦 可抑制瘤细胞中的HBV基因表达。 构建含荧光蛋白的真核表达载体,转染HepGZ细胞后,原位证 实细胞内可表达核酶,经皮下、静脉注射*、鼠,发现*、鼠肌肉及肝 脏细胞中亦可表达核酶。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R373.21;R512.62

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【参考文献】
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