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《第四军医大学》 2001年
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外源性p16基因对食管癌细胞系的生长抑制作用

孙晓雁  
【摘要】: 随着现代分子生物学理论和技术的深入和发展,人们认识到从细 胞基因水平的异常能够更为深入细致地解释细胞癌变的过程。在高等 真核多细胞生命体中,存在着一个极为复杂而精确的分子调节网络, 维持细胞的正常性状以及细胞群的稳定。在所有的恶性肿瘤中都存在 着癌基因的激活,扩增和/或抑癌基因的失活,缺失。同时也普遍存 在着细胞周期和凋亡的调节失控,导致癌变细胞凋亡减少,长时间处 于增殖状态。 我国食管癌发病率高于世界水平,是一种预后较差的常见恶性肿 瘤。本研究的目的在于通过对细胞周期调节基因p16转染食管癌细胞 的研究,了解p16在食管癌基因治疗方面的可能价值。p16ink4的表 达产物在细胞G_1期可特异性地与CyclinD_1/CDK4复合物结合,阻止其 对pRb蛋白的去磷酸化作用,从而阻止G_1期至S期的转化。在多种肿 瘤细胞中均观察到这一现象,因此p16也称为多肿瘤抑制基因(MTS1)。 有研究报道在食管中p16有较高的缺失率。p16蛋白的表达状态也与 食管癌的临床病理分期和淋巴结转移率有关,而且在食管鳞癌中更为 普遍一些。因此通过导入外源性野生型p16基因,上调p16蛋白表达 水平将可能观察到食管癌细胞生长受抑制的现象,为食管癌更有效的 基因治疗打下基础。 本实验利用分子克隆技术将p16cDNA编码区片段成功地克隆到 PcDNA3表达质粒上,构建PcDNA3-p16真核表达系统。利用脂质体 转染技术术将PcDNA3-P16和PcDNA3-neo导入了食管鳞癌细胞系 弟四军医大学博士学位论文 pC109中,证实了有p16蛋白表达,而对照组无p16蛋白表达,并检 恻了其瞬时表达和稳定表达时的细胞生长状况. 免疫组化(Supe。i幻on)和兔疫荧光染色提示外源性p16基因导 入 E C109细胞后有 P16蛋白表达和大量 wA拷贝,证实 T P16已成 功导入 Ea09细胞并表达相应蛋白产物.而对照组均为阴性. 对转染后生长状况的观察:我们发现在P16转染后72小时左右, 一 细胞生长明显减慢,细胞内可见透明颗粒、细胞间隙变大、细胞肿胀、 脱落悬浮,此时提取细胞进行了流式细胞检测,发现有亚Gl峰出现; 透射电镜观察可见细胞线粒体肿胀,染色质核膜下聚集,有凋亡小体 形成;DNA片段化电泳发现梯状电泳带,以上现象均提示有细胞凋亡 存在. 穗定表达时通过MTT染色法测定生长抑制率发现pl6转染组有 35.l%抑制率,流式细胞仪显示转染P16后细胞Gl明显升高,有Gl期 阻滞发生(P<0刀工),细胞克隆形成率和生长曲线与对瓜组相比,均 有显著差异(P<0.01),证实了外源性…6基因的生长抑制作用. 以上实验结果我们认为外源性盯 基固对食管癌细胞有明显的生 长抑制作用,瞬时表达还可以诱导细胞凋亡.其中的机理可能是:① p16蛋白可抑制Cyclin-D;/CDK4活性,阻止pAn活化从而造成Gl期阻 滞①细胞凋亡调节是由多囚子调节完成,但主要发生在周期阻滞的 个 细胞,因而外源性P16使细胞周期停滞,则细胞易于发生凋亡。 总之,P16基因在食管癌基因治疗方面有其潜在的应用价值.
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R735.1

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