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《第四军医大学》 2001年
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泌尿生殖系肿瘤无限细胞系的建立及肾癌高转移株的筛选和刺激同源CTL的实验研究

王鹏飞  
【摘要】: 肿瘤细胞系是肿瘤研究的基础,但是随着细胞系在体外的不断传代, 其性质会逐渐改变,所以建立新的细胞系有重要意义。建立肿瘤无限细 胞系是一个繁复的工作,而泌尿生殖系肿瘤细胞系的建立尤为困难,近年 来在该研究领域中引入免疫缺陷动物,提高了建系的成功率。大量实验 证明,临床标本移植于裸鼠皮下,肿瘤生长后与原来肿瘤细胞在形态学、 病理学、分子生物学等方面保持高度一致。肿瘤转移和免疫逃避是肿瘤 的两个重要特征,对这两个性质的研究是目前肿瘤研究的热点。肿瘤转 移模型的建立和高转移性细胞株的筛选是研究肿瘤转移机制的基础,实 验证明,肿瘤移植于裸鼠皮下转移率很低,原位移植模型的建立提高了肿 瘤转移发生几率,能很好地模拟临床肿瘤的特性。多种类型临床肿瘤标 本建立肿瘤组织块原位移植即SOI模型获得成功,比细胞悬液原位注射 的转移发生率高。总之,原位移植模型为观察肿瘤的转移性状及筛选肿 瘤高转移株打下了很好的基础。肿瘤的免疫治疗学一直因为肿瘤的免疫 源性较弱而发展缓慢,但人们在黑色素瘤的研究中发现利用病人TIL和 外周血淋巴细胞在同源肿瘤细胞刺激下可以在体外诱导出CTL细胞。 CTL是体内杀伤肿瘤作用最强的细胞,进而有学者利用CTL在MHC-Ⅰ 类分子的限制下识别肿瘤相关抗原这一特点,筛选出了一系列肿瘤抗原, 从而拓宽了肿瘤免疫治疗学的研究领域。CTL和DC-抗原肽嵌合疫苗 已应用于临床并取得了显著效果。 本实验首先对43例各种泌尿生殖系统肿瘤进行了建系工作。同时 利用了3种方法:组织块直接培养法、细胞悬液法、裸鼠皮下移植法。最 第四军医大学博士学位论文 后通过裸鼠皮下移植法建立了3个细胞系:肾透明细胞癌RCC-9863、膀 眺移行细胞癌BC-6、前列腺梭行细胞瘤PC-98106。3种细胞均按文献 要求进行了鉴定,符合肿瘤细胞的特性,它们在体外连续传代也都超过了 100代,可以认为是无限细胞系。而组织块直接培养法和细胞悬液法可 使纲胞在体外传代最长至20余代,但无一例建系成功。 利用原代细胞充分保持细胞特性的特点,我们从第1代荷肾癌的裸 鼠体内取组织块建立SOI模型。约1月左右裸鼠出现明显恶液质症状并 有呼吸急促,而皮下荷瘤鼠2个月以后仍然正常存活。解剖棵鼠发现原 位移植肿瘤成侵润性生长,并伴淋巴结和肺脏转移,肝脏连续切片也发现 微转移灶。从肺脏中取下转移灶体外培养再进行裸鼠原位注射,裸鼠肺 脏转移灶较上一次增大,再进行体外组织培养,所得细胞重复原位注射, 最后筛选出了 1株肺脏高转移株 MRCC。免疫组化提示 MRCC细胞PC- NA表达增高W胶原酶表达增高,"m23表达两者无明显差别。MRCC细 胞裸鼠皮下注射成瘤快,解剖发现肺脏有微转移灶,说明MRCC是一株 有高转移潜能的细胞亚株。 我们取RCC-9863病人外周血,分离淋巴细胞,在低剂量IL-2作 用下,用照射后的RCC-9863细胞刺激外周血淋巴细胞。刺激4次后, 淋巴细胞明显增殖,细胞变大,成逗号或豆芽菜状。细胞毒实验证明该细 胞对RCC-9863有特异性杀伤作用,而对GRC-l、h4JIU-87JC- 3、hCaP、K562细胞没有杀伤作用。流式细胞仪提示该细胞CD3”表达 率为96.7%,CDS”为64%。单抗阻断实验证明该淋巴细胞的杀伤作用 受 MHC-l分子限制,主要的杀伤细胞是 CDS+细胞。以上实验证明该 细胞是CTL细胞。但CTL在体外的培养时间仅仅为3个月,CTL的长期 培养还需进一步摸索。 结论:我们利用裸鼠建立了3个肿瘤细胞系,成功的建立了肾癌原位 移植模型,并筛选出了二个肺脏高转移亚株,为肾癌转移机理的研究打下 了基础。我们还同时对肾癌CTL的体外培养进行了初步探索,证明肾癌 存在肿瘤相关抗原,为肾癌抗原肽疫苗的进一步研究提供了实验基础。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R737.11

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