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《第四军医大学》 2002年
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人胚胎原生殖细胞的分离培养

谢松涛  
【摘要】: 胚胎多潜能干细胞包括胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES cells)和胚胎生殖细胞(Embryonic germ cells,EG cells),这些细胞具有自我更新能力和高度增殖以及多向分化潜能,并可以定向诱导分化为该生物体所有种类的细胞,甚至形成复杂的组织和器官。人ES和EG细胞对于人类胚胎发育、疾病研究、器官移植、基因治疗以及新药的研制筛选等方面提供了一条新思路。 胚胎原生殖细胞(primordial germ cells,PGC)是国外用作分离和克隆干细胞的一种新细胞资源,直到近年来,其本来面目才逐渐被揭示开来。本研究从5-9w人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞(PGC),并对PGC的体外培养和分化进行了研究,为进一步PGC的诱导分化等研究提供实验材料。 1.小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)和人胚胎成纤维细胞(HEF)的分离培养 饲养层细胞能够分泌LIF、SCF和bFGF,对于培养中PGC的存活和增殖是必需的,不仅可以使其数量增加,而且与PGC在体内和体外的分化有关。本实验以妊娠13-14d昆明小鼠和临床人工终止妊娠的废弃胎儿(5-9w)为材料,建立了PMEF和HEF分离培养体系:采用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA作用3-5min得到理想的PMEF和HEF;并采用差速贴壁分离法纯化PMEF和HEF;PMEF和HEF对PGC的培养结果显示无显著差异。 2.大鼠心肌细胞的分离和培养 国外许多实验室采用大鼠肝细胞(BRL)等制作条件培养基(CM)来维 审囚军区大学项士学位论文 持 ES细胞。这些 CM中都含有相当高含量的* 和 SCF等因于,这些因子可 以有效地抑制干细胞的分化。国内也有采用大鼠心肌条件培养基(N-CM) 成功建立和维持小鼠ES细胞系的报道。本实验大鼠心肌细胞取自于新生Zd 的SD大鼠:采用低浓度胰蛋白酶分段消化收集的方法,可有效减少消化对于 心肌细胞的损害;并采用差速贴壁分离法纯化心肌细胞,可获得纯度大于90% 的心肌细胞。心肌细胞在培养 10 h后贴壁,个别细胞有搏动,24 h后约 60% 的细胞在搏动。培养的心肌细胞一般可存活 10 d以上。结果显示:培养 3.6d 的心肌细胞搏动频率最稳定,细胞形态保持最好,故而选取该时问收集培养液, 制作条件培养基。 3.人胚胎原生殖细胞的分离和培养 我们选用5-gW(受精龄)临床人工终止好娠的废弃胎儿29个,将其生殖 峭组织消化后接种在饲养层上,使用RH(M培养得到第四代PGC 2株。AP 染色呈阳性。体外分化实验(致裸鼠成瘤实验)显示此细胞具有发育多能性。 在分离过程中,其在饲养层上有三种克隆形式:较大的克隆包括没有散刀‘的生 殖峭体细胞和P*C,更易增殖,且不易分化:单个或由于迁移运动而聚集**C 介始以单层方式增殖,可形成多层细胞的克隆,前者克隆较小,后者克隆较大, 单个PGC和较小的克隆容易分化。 离散生4自峭和增殖PGC克隆时机和方法是影响建系的关键因素。本研究 发现:**C在丁爿容易发生白然分化,故…Z在培养5-“时进行**C克隆的 离散;俏化时问过K则细胞死亡率增加,单个*GC @广数量增加,且消化组 织块时还可导致杂细胞增多,囚此,当PGC集落消化为若干细胞个细胞团时, 就应中止消化,不要分散为单个细胞。PGC在无饲养层、’(k养层不良、延长 培养和悬浮培养时能够自然分化。分化出内胚层样细胞、神经细胞、成纤维细 )地、上皮样细胞、l(IL内皮细胞和胚体(EB)。我们把 PGC细胞注入裸鼠体 内,29d后得到畸胎瘤。证实了此细胞在体内的发育多能性。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q813.1

【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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