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《第四军医大学》 2002年
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小鼠胚胎性干细胞体外培养

冯智  
【摘要】: 由于胚胎性干细胞理论上具有多能性并具有自我更新能力,在体外培养过程中加入合适的诱导分化剂可以产生需要的特殊细胞类型,从而引起了人们的关注。将胚胎干细胞技术与其他生物技术相结合,可以生产基因型和表现型完全相同的克隆动物,可以导入外源基因得到新的并且可以稳定传递表性特征的转基因动物。胚胎干细胞的广泛应用对畜牧业生产、药用蛋白生产、建立人类疾病动物模型甚至临床器官移植或器官、组织修复材料等方面的研究具有极大促进价值。 胚胎干细胞在医学上的研究主要集中在人类疾病模型、发育调控、基因研究和临床器官、组织修复材料等方面。众所周知,烧伤整形或创伤患者由于各种各样的原因,始终存在皮源不足的问题。如果能够从胚胎干细胞诱导分化得到皮肤组织细胞,则为解决此问题开拓了一条新的思路。但是目前关于人胚胎性干细胞的研究仍然处于初始阶段,我们对小鼠进行相关的实验研究,为以后进行人胚胎干细胞的培养和诱导分化工作摸索条件。 采用孕后第10日的小鼠为实验动物,镜下分离生殖嵴,以小鼠原代胎儿成纤维细胞饲养层(PMEF),α-MEM,添加15%NBS,0.1mM2—巯基乙醇,0.1mM谷氨酰胺,100IU/ml bFGF,1mmol/l非必需氨基酸,1mmol/1丙酮酸钠作为培养基,辅以PMEF条件培养液,采用Percoll细胞分离液和手工挑克隆相结合的方法为传代手段进行细胞培养,对其进行了形态观察和AKP染色鉴定。并采用无血清培养液和延长换液间隔 第四军医大学硕士学位论文 的方法来诱导分化胚胎性干细胞。另外对不同浓度的丝裂霉素C制作饲 养层细胞的增殖进行了验证。 我们从80只雌鼠体内选择140个胚胎来收集PGCS,分离到5个传 3代的胚胎性干细胞克隆。观察到了胚胎性干细胞活跃运动,对干细胞 克隆进行AKP染色呈现阳性结果。条件培养液可以延迟胚胎性干细胞的 死亡,使其从第4 日左右推迟到第6 日左右。药物浓度筛选实验表明 10微克加 的丝裂霉素 C可以较好的抑制成纤维细胞,使其在处理后的 第4日仍然可以保持较稳定的细胞数量。胚胎性干细胞的体外分化有神 经细胞、内皮细胞、心肌细胞和表皮样细胞。 我们从实验中得出如下结论: 1.以小鼠原代胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层作为分化抑制物,添加 PMEF条件培养液,可以增加胚胎性干细胞的存活时间。 2.在10ug砌 的丝裂霉素C对于饲养层细胞的制备具有较好的效果。 3.Percoll 细胞分离液配合手工挑克隆法在普通实验室中是更简便的 方法c。 4.从体外培养和诱导分化的结果来看,可以实现从胚胎干细胞获得表 皮样细胞。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R329-33

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