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《第四军医大学》 2002年
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DNA微阵列技术对DMD基因缺失检测的基础与临床研究

杜文津  
【摘要】: DMD和BMD是一组X连锁隐性遗传的神经肌肉系统疾病,特点是进行性加重的肌肉萎缩与无力。发病率为活产男婴的1/3500。该病发病率高,危害大,为遗传病研究中的重点之一。至今尚无有效的治疗方法,故及时确诊患者、检出携带者和进行产前诊断成为降低本病的最重要措施。 DMD基因定位于人类X染色体短臂Xp21上,长度为2500kb,由79个外显子和78个内含子构成。基因的编码产物为抗肌营养不良蛋白(dystrophin),是一种分子量为427kD的糖蛋白,位于骨骼肌细胞膜内,对于维持肌细胞的骨架结构、保持膜内外钙离子的正常浓度至关重要。DMD基因具有突变频率高且突变形式多样之特点。早期研究发现,基因突变中缺失占55%-65%,点突变占25%左右,重复占5%-10%,其它微小缺失和微小重复占8%左右。可见DMD基因的部分或全部缺失为该病的重要病因之一。该基因通常断裂发生于内含子中,而导致断裂点之间一个或几个外显子的缺失。DMD基因缺失集中在两个热点区域:一个在该基因的5’端,包括外显子2-20,占总缺失的30%;另一个在中央区,包括外显子44-53,占总缺失的70%。基因缺失的位置和大小无固定规律。鉴于这种特点,其主要缺失可以通过对一系列外显子的检测来发现。 目前国内外许多单位均已开展了DMD基因诊断,对基因缺失的检 第四军医大学硕士学位论文 测主要是通过用cDNA探针的Southern印迹或用经典引物的PCR方法 进行的。尽管这些方法应用很广泛,但它们也有一定的局限性,不能对 大量可能缺失的片段同时进行检测。DNA微阵列技术则可以用来同时检 测大量外显子信息。微阵列所包含的外显子信息量越大,其优越性越明 显,突出表现为检出率的提高和克服了PCR选择引物的盲目性。 本实验分为基础研究和临床研究两部分。基础研究致力于外显子探 针的制备(基因工程的方法)和DNA微阵列的研制(合成后点样法); 临床研究则应用DNA微阵列技术检测临床患者的DMD基因缺失倩况。 具体实验方法和结果如下: 1.由健康人外周静脉血白细胞提取基因组DNA。以基因组DNA 为模板,应用 Chamberlain等和 Beggs等设计的 18对引物,对 DMD基 因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增。将扩增产物与pGE炉1 E卿 载体连接,转化ECOli JM109感受态细胞。通过平板培养,挑选阳性克 隆。提取重组质粒,Not酶切,获得完整的克隆片段,并作测序鉴定。 通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank 收录序列的相似性。克隆和测序结果说明,扩增到的产物确为DMD基 因外显子 4、44、12、8、sl、17、19、48、45、52、60、47、6、13、 50、43、3、49片段,与己报道的序列具有极高的相似性。这些片段长 度分别为196、268、331、360. 388、416、459、506、547、113、139。 181、202、238、271、357、410、439hp。通过上述基因工程的方法可以 大量制备这些外显子片段,并为DNA微阵列的研制做好了探针方面的 准备。 2.以此克隆产物作为检测DMD基因常见易缺失外显子的核昔酸探 针。在NC膜上固定探针,标记扩增待检样品,进行传统的反向斑点杂 交试验。初步验证了探针的特异性。 3.用APESs*yLyS对普通载玻片进行处理(分别用APESIOlyLyS 单独处理,以及用APES和POlyLyS共同处理)后,固定FITC荧光标 记的人类基因组 DNA随机扩增样品,以不同浓度的盐溶液(dHO,PBS pH7.4,0*XSSC,ZXSSC,SXSSC)冲洗。测定玻片的不同处理方式和 洗涤方式对固定的核酸样品牢固性的影响程度。结果表明,核酸样品都 一6一 第四军医大学硕士学位论文 会在洗涤过程中有所脱落,其程度随着溶液盐浓度的增加而增大:不同 处理的玻片在核酸固定效率上略有差别,以APES和POlyLyS联合处理 的玻片固定效率最高。 4.以 APES和 POly-LyS联合处理的玻片为固相支持物,以克隆得到 的 18个 DMD基因常见易缺失外显子片段为探针,利用点样法制备简易 微阵列。另设 8-acin的 DNA片段为阳性对照,pUC gffiCORI的 DNA 片段为阴性对照。共 20个点,组成 5 X 4阵列。对待检的核酸样品进行 ienow法随机引物扩增,同时掺入FITC荧光标记dUTP。用荧光显微 镜观察微阵列杂交后荧光信号的分布,缺乏荧光信号的点提示该点所包 含的基因片段在待检样品中缺失。 5.应用DNA微阵列技术对临床收集的30例DMD$MD、l例面肩 肪型肌营养不良、2例强直性肌营养不良、二例遗传性痉挛性截瘫患者和 5例正常人进行DMD基因缺失型突变检测。结果显示:30例DMD用MD 患者中有 ZI例至少存在一个外显子片段缺失,占 70%;9例未被检测到 缺失。ZI例缺失型突变中单个外显子缺失和多个外显子连续型缺失分别 为二例和 10例,非连续型缺失为 9例。具有外显子缺失的患者中,11 例缺失部位集中于第44-53号外显子,5例集中于第2-20号外显子,5 例在以上两个区域均有缺失。其中 45、sl号外显子缺失频率最高,44、 48
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R746

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【参考文献】
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