HSV-tk、重组人IL-2、TNF-α基因共表达载体的构建及HSV-tk/GCV系统对喉癌细胞作用的体外研究
【摘要】：
目的：构建含有HSV-tk、IL-2、TNF-α基因不同组合的共表达逆转录病毒载体；研究HSV-tk／GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。
方法：(1)分别以PCR方法扩增各目的基因，扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy，挑取阳性克隆经鉴定后测序，将测序正确的各目的基因通过引入内部核糖体进入位点依次定向克隆正向插入至pLXSN表达载体的多克隆位点间，以构建含不同基因的共表达载体。(2)利用重组DNA技术，将HSV-tk基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中，重组质粒pL(tk)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞，G418筛选，直至出现抗性克隆，扩大培养，用NIH3T3测定病毒滴度，将重组病毒感染人喉癌细胞Hep-2，G418筛选出抗性克隆，命名为Hep／tk，以PCR、RT-PCR对HSV-tk基因修饰的Hep-2细胞进行鉴定。通过观察基因修饰细胞生长状况、MTT法及流式细胞仪观察GCV对Hep/tk细胞的杀伤效应。
结果：(1)经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定，各插入基因序列、大小、位置、方向均正确无误，成功构建三基因不同组合共表达载体
第四军医大学硕士学位论文
PL（TI）SN和灿（TT）SN。（2）构建了出基因表达载体“（tk）SN；获得高自
度产毒细胞株 C26；酒度为 1石X106／nil，PCR及 RTPCR分析证明 HSV业
基因已整合至 Hep／th细胞基因组中，并在 InRNA水平上表达；Hep／tk细胞
与未转基固的 H印0、HepZ比较，三者的生长速度无明显差别；Hep／th细
胞对 GCV高度敏感，即低浓度 GCVN－lin叭）处理 Hep／tk细胞 7天，可将
其大部分杀死，高浓度GCV卜lin叭）不能显著增强其对Hep／th细胞的杀伤
作用。
结论：三基困不同组合共表达载体的成功构建为喉癌的联合基因治疗
提供部分实验驹。人喉癌细胞＊Cp2对＊S（W＊＊V系统高度敏感；可
望为喉癌基困治疗提供有效途径。
【关键词】：HSV-tk基因 喉癌 共表达 基因治疗 【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R739.65
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2002.081363
【目录】：
- 缩略语表4-6
- 中文摘要6-8
- 英文摘要8-10
- 前言10-11
- 文献回顾11-25
- 实验研究25-62
- 第一部分 HSV-tk、重组人IL-2、TNF-α基因共表达载体的构建与鉴定25-42
- 材料与方法25-35
- 结果35-38
- 讨论38-42
- 第二部分 HSV-tk自杀基因逆转录病毒表达载体的构建及包装42-51
- 材料与方法42-46
- 结果46-48
- 讨论48-51
- 第三部分 HSV-tk／GCV系统对Hep-2细胞作用的体外实验51-62
- 材料与方法51-55
- 结果55-58
- 讨论58-62
- 小结62-63
- 参考文献63-72
- 致谢72
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