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《第四军医大学》 2002年
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鼠ADAR1细胞内定位及其新亚型的鉴定研究

聂勇战  
【摘要】: 背景及目的 ADAR1作为RNA编辑酶家族的一个成员,通过编辑pre-mRNA参与中枢神经系统GluR、5-羟色胺等离子通道相关受体的特定氨基酸编码位点的替换(如Q/R位点的替换),从而直接影响蛋白的结构和功能。但人们对其他脏器、组织和细胞中ADARl的功能知之甚少,很可能并未掌握它的本质功能。我室以往的研究证实ADARl不同亚型在细胞内的定位不同是由于其分子内包含了多个进核、出核信号所致。另外发现,小鼠ADARl在内毒血症中因为RNA的剪辑出现了多个新的剪辑体。因此,本研究的目的即针对以上现象和问题进行更为深入的探讨。 方法:试验中采用了基因的亚克隆技术以及目的蛋白与GFP标签融合的瞬时转染技术,并辅助细胞免疫荧光化学用于研究ADARl在细胞内的转位变化。另外,我们主要采用免疫引迹(Western Blotting)技术,首先系统地调查了正常小鼠不同组织蛋白以及LPS刺激模拟内毒血症小鼠的组织器官蛋白中ADAR1表达的不同;其次探测了肿瘤细胞系以及小鼠正常和经促有丝分裂原(PHA.ConA,LPS)如或细胞因子(如TNF-α IL-2)刺激活化的原代淋巴细胞中ADARl的表达变化。针对ADAR1的诱导表达,采用基于TLC(薄层层析技术)的dsRNA体外编辑活性的检测方法,代表性地分析了经诱导ADAR1高表达细胞中的A-I编辑酶活性的水平。 结果及结论:1.首次证实ADARli并非一种穿梭蛋白,由此进一步阐明了位于ADARli的zDNA结合结构域中的出核信号NESs在ADARli定位于胞浆中的主导地位。并进一步支持了ADARli和ADARlc在细胞的不同部位发挥不同生物学功能的假设。2.克隆获得了ADARl特异性结合核仁的最小功能基序APNKIRRIGEL。3.从蛋白质水平系统 第四军医大学博士学位论文 聂勇战 调查了ADARI在小鼠主要脏器和组织细胞中的正常分布谱,发现ADARI在中枢神经 系统以外富含未成熟细胞的免疫器官和睾丸中高表达。4.初步证实了小鼠ADARI可能 存在其他新的亚型。5.初步证实了 ADAR的不同亚型可能存在磷酸化与非磷酸化两种 蛋白形式,并高度提示正常细胞的分化增殖和活化以及肿瘤细胞的恶性增殖与ADARI 的非磷酸化形式相关。6.初步获得了 ADAR与免疫细胞尤其是 T淋巳细胞的分化成熟 相关联的证据。以上结果为进一步阐明ADADI在神经系统以外的其他脏器和组织细胞 中的本质功能奠定了可靠的试验基础。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R346

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