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《第四军医大学》 2002年
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大鼠胃平滑肌细胞、壁细胞GnRH及其受体的研究

陈蕾  
【摘要】: 促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是由下丘脑神经元分泌的一种含有十个氨基酸的肽类激素,经下丘脑-垂体-门脉系统进入垂体前叶,作用于垂体前叶的促性腺激素分泌细胞,刺激卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone,LH)的分泌,从而调节性腺的发育与配子的形成。已有大量证据表明,GnRH及其受体可广泛存在于下丘脑-垂体轴之外,如免疫系统(T、B淋巴细胞)、生殖系统(卵巢、输卵管、前列腺、睾丸及胎盘等处)以及一些恶性肿瘤(乳腺癌、肺癌、胰腺癌及肝癌等),对这些组织和器官及恶性肿瘤的生长起调控作用。 我们先前的研究表明,在大鼠的消化系统广泛存在有GnRH及其受体,并且其受体的基因序列与垂体的基因序列一致,说明大鼠的消化系统能自身合成GnRH及其受体,同时这些组织或细胞是GnRH作用的靶细胞,如GnRH类似物可明显促进大鼠颌下腺对神经生长因子的分泌。那么,在培养的大鼠胃平滑肌细胞、胃粘膜壁细胞是否存在有GnRH及其受体,其GnRH的基因序列怎样?GnRH对它们的功能影响如何?均未见报道。因此我们 第囚军匡大学谬玄学伍沦文 在先前研究的基础上,进行了以下研究:D」首先对大鼠的胃平滑肌细胞 进行了分离培养及鉴定,并采用免疫细胞化学、原位杂交技术在培养的平 滑肌细胞上原位检测GnRH受体的表达;[2]运用放射免疫分析法检测了 GnRH类似物对大鼠胃平滑肌细胞PKC酶活性的影响,然后运用激光共聚 焦技术检测了GnRH类似物对胃平滑肌细胞内Ca’”浓度的影响,以探讨胃 平滑肌细胞内 GnRH受体介导的信号转导机制:[3]GnRH类似物对培养的 胃平滑肌细胞处理后,分别采用*T比色法、’H-TdR掺入法、检测PCNA 法和流式细胞仪技术观察GnRH类似物对平滑肌细胞增殖情况及细胞周期 分布的影响:「d对大鼠的胃壁细胞进行了分离培养及鉴定,运用形态学 研究的方法检测了GnRH及其受体在培养的胃壁细胞上的分布,并运用 RT-PCR、基因克隆测序等技术对壁细胞分泌的GnRH基因序列进行了研究; [5] 用激光共聚焦技术检测GnRH类似物对培养的大鼠胃壁细胞内Ca’”浓 度的影响,同时检测了GnRH类似物对在体大鼠胃酸分泌的作用,进一步 了解GnRH对消化系统功能的调节,为先前提出GnRH也是一种胃肠激素 的新观点提供更直接的实验依据。 主要研究结果如下: 1.运用免疫细胞化学和原位杂交的方法发现,培养的大鼠胃平滑肌 细胞含有GnRH受体免疫反应阳性物质,同样含有GnRH受体InRNA杂 交信号,二者均位于细胞浆内,胞核为阴性,说明培养的胃平滑肌细胞能 表达GnRH受体,是Gs作用的靶细胞。 2.运用放射性同位素的方法检测了GnRH类似物(阿拉瑞林)对大鼠 胃平滑肌细胞PKC &活性的影响,发现阿拉瑞林可使培养的大鼠胃平滑肌 细胞中PKC活性明显升高,3Inin时达高峰,10Inin后作用明显降低,且 成剂量依赖性;同时发现在无外CaZ”时,阿拉瑞林也可使PKC活性升高, .5- 第回军皿大学傅士学伍论文 但不如有外钙存在时高o<0.05卜因此PKC活性的增高,并不完全依赖细 胞外C八 它可以动员胞内*“的释放激活PKC。 3.阿拉瑞林可使胞内叨”浓度升高,说明*”参与了GnRH类似 物阿拉瑞林对胃平滑肌细胞作用的细胞内分子转导过程,而细胞内*扩 的升高既源于细胞内钙的释放又源于细胞外钙的内流,外钙的内流主要是 通过L-type钙通道实现的,内钙的释放不是通过RyRs受体,而是通过IP3 受体实现的。 4.细胞的增殖实验表明,随着阿拉瑞林浓度的增大,与未用药的对 照组相比,发现其M17’吸光度K值)逐渐降低(<0刀5);P CNCNA表达的平 均荧光值逐渐减弱o<0刀5):大鼠胃平滑肌细胞的’付*皿参入量依次减 少(P<(、05卜 且药物浓度越大,此三者下降越明显。在细胞周期中,与对 照组相比,GI期细胞所占比例明显增加(P<.05h S期细胞所占比例明显 减少,且随药物浓度的增加而逐渐减少o<0刀5卜说明*nRH类似物可明 显抑制大鼠胃平滑肌细胞的增殖作用,其作用途径可能是通过平滑肌细胞 自身GnRH受体的直接介导而实现的。 5.运用细胞培养技术对大鼠的胃粘膜壁细胞进行了分离与培养,然 后采用形态学的研究方法,研究了GnRH及其受体在大鼠胃粘膜壁细胞中 的表达,发现胃粘膜壁细胞中含有GnRH蛋白和GnRll-mRNA,H者均定位 于细胞浆内,并且发现GnRH受体蛋白及其GnRH受体的IuRNA也定位于细 胞浆内,这提示大鼠胃粘膜壁细胞可自身合成和分泌GnRH,在胃粘膜壁 细胞GDRH可能以自分泌的方式调节壁细胞的功能。 6.我们从培养的大鼠壁细胞中提取总RNA,应用RT-PCR的方法扩 增Gngu基因,并对产洲行纯化回收,连接入pUC19 &体中扩增,经eR 和酶切鉴定后进行序列分析。结果发现胃壁细胞中GnRH的基因序列与下 丘脑的完全一致。 .6.
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R329

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