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《第四军医大学》 2002年
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人源性胶质瘤噬菌体抗体库的构建及初步筛选

王彦刚  
【摘要】: 脑胶质瘤是严重危害人类健康的常见肿瘤,致残、致死率较高。尽管采用了手术、放疗和化疗等多种治疗措施,但患者的预后仍不够理想。近年来,免疫治疗逐渐成为新的研究热点,并有望作为一类新的治疗方法。然而, 目前免疫治疗的受限点是难以获得特异性抗体。由于现有抗体的异源性,这给临床应用带来了不便,故制备新的特异性人源性抗体便成为了急需解决的问题。噬菌体抗体库技术作为基因工程抗体制备的代表技术,避开了以杂交瘤技术制备抗体的繁杂步骤,为高效生产抗体提供了一个新的途径。我们利用该项技术成功地构建了人源性胶质瘤噬菌体抗体库,并进行了初步筛选。 1.抗体库的建立 应用免疫组化和ELISA法,筛选出抗胶质瘤自身抗体阳性患者,抽取这些患者的血样(50ml/份),利用梯度离心法从中分离出淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA。根据Kabat基因库设计出人抗体基因引物,经巢式PCR扩增出人抗体可变区基因,第一轮扩增出约700bp产物(V_H、Vκ),第二轮扩增出约320bp(Vκ)和360bp(VH)产物,第三轮扩增出约400bp 第四军匠大学俗士学位论文 (VJ和 400hp(V。)产物c将最后一轮扩增出来的轻、重链基因分别克 隆入载体pUC18,构建成轻、重涟基因库。然后将重链基因克隆入轻链库中, 构建成 2 XIO’单链抗体基因库。从该基因库中获取完整的单链抗体基因,将 其重新克隆入表达载体pDNAS,电转化E.COlt TGI并超感染制备成原始噬 菌体抗体库。此库感染 ECOli BS1365,使单链抗体基因发生重组,并经辅助 噬菌体VCSN413超感染,构建成重组的噬菌体抗体库,测定滴度为3.SX10‘\ 重组库再感染 E Colt DHS Q F,,继之超感染构建成最终的噬菌体抗体库。 2.抗体库的筛选 将抗体库与胶质瘤细胞系BT325孵育,结合的噬菌体用pH 2.2的盐酸- 甘氨酸洗脱缓冲液洗脱,并感染 E.COlt TG进行增殖。为了降低无关噬菌体 的给合,提高信/噪比,在筛选过程中采用竞争结合法,首先将噬菌体抗体库 与胶质瘤细胞结合,然后加入一定量的正常胶质细胞,在悬浮状态下竟争结 合噬菌体抗体。竞争结合后利用贴壁生长特性回收胶质瘤细胞及结合的噬菌 体抗体,再经过梯度洗脱,剔除低亲和力的噬菌体抗体,获得与胶质瘤细胞 有一定结合能力的噬菌体抗体。 3.细胞结合ELISA分析 经过四轮筛选,用胶质瘤细胞结合ELISA检测,有40%的克隆显示阳性, 说明筛选效率较好。进而用正常胶质细胞进行细胞结合ELISA,获得7个克 隆不与正常胶质细胞结合,再继续对此7个克隆进行细胞结合测定,最终获 得3个只与胶质瘤细胞结合,而不与正常胶质细胞结合的。有一定特异性的 克隆。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R739.41

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【参考文献】
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【相似文献】
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