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《第四军医大学》 2002年
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抑癌基因P27对增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用

董茂龙  
【摘要】: 目的:瘢痕形成是创面愈合的必然结果,但瘢痕增生过度瘢痕挛缩,常常导致各种畸形功能障碍,给患者带来身心痛苦。多年来,瘢痕增生一直无确切的治疗方法。基因治疗是分子生物学的主要应用领域之一,理论上可以从根本上阻止许多疾病的发生与进展,并有望达到治愈的目的。基因治疗在肿瘤等疾病的防治研究中一直是研究的热点,但如何选择靶基因及靶细胞成为其关键。越来越多的实验证实细胞周期调节蛋白p27对许多肿瘤有抑制作用,因此p27又被称为抑癌基因,是肿瘤抑制性治疗的重要候选者,但其在瘢痕增生过程中的作用尚不清楚。本实验用Western Blot检测增生性瘢痕与正常皮肤组织p27蛋白的表达差异,提示p27可能与瘢痕形成有关;然后以体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast,HTsFb)为靶细胞,以抑癌基因p27为目的基因,将构建的pcDNA3-p27真核表达质粒体外转染HTsFb,观察抑癌基因p27对HTsFb的生物学作用,为开展瘢痕的基因治疗提供实验和理论依据。 方法:1.用WesternBlot检测增生性瘢痕与正常皮肤组织p27蛋白的表达;2..PCR法从含有p27全长的质粒中合成p27 cDNA片段,连接酶连接至pUC19质粒进行测序,证明PCR产物序列完全正确,限制性内切酶HindⅢ与EcoRI酶切pUC19-P27,获得p27 cDNA片段,连接酶连接至pcDNA3,克隆出真核表达质粒;3.利用脂质体介导的基因导入法将pcDNA3-p27导入HTsFb用Western Blot与免疫组化检测细胞转染后p27蛋白的表达情况;4.检测p27对HTsFb的生物学效应:①采用MTT、~3H-TdR掺入法观察p27对HTsFb增殖与DNA合成的影响;②用流式细 第四军医大学博士论文 一 胞仪检测p27对HTSFb的细胞周期的影响;③末端脱氧核昔酸转移酶介 导的 dUTP切口末端标记(Terminal deoxynucleotibyl transferase (TdT)*ediated dUTP nick end labelins,TUNEL)法观察 p27对 HTSFb凋亡的影响;④用原位杂交法观察p27对HTSFb胶原合成的影响; ⑤用成纤维细胞-胶原网(Fibroblast collagen co血action l扣ice)收缩模型观 察了p27对HTSFb胶原网收缩的影响;③用透射电镜观察p27基因转染 对HTsFb的超微结构的变化。 结果:1.增生性疲痕P27蛋白含量明显低于正常皮肤组织,提示P27 可能与疲痕形成有关; 2.成功构建了p27真核表达载体pCDNA3中27; 3.pCDNA3个27成功转染HTSFb,并检测到p27蛋白的稳定表达; 4.①p7对*nFb增殖与**A合成有明显的抑制作用: ②p27使 HTSFb S期细胞比例明显降低,GO凡 期细胞比例升高; ③原位检测法观察p27能促进HTSFb凋亡; ④用原位杂交法观察p27能抑制HTSFb合成胶原; ⑤p27在早期能促进HTSFb胶原网的收缩影响,后期作用相反; ③电镜观察显示pZ 7使HTSFb的超微结构呈现生长抑制特征。 结论:在成功构建p27真核表达载体pCDNA3个27的基础上,将其 转染HTSFb并得到稳定表达;初步证实p27可能通过抑制的HTSFb增 殖及DNA合成,干扰HTsFb的细胞增殖周期,抑制HTsFb的胶原合成 等途径来抑制撅痕增生,为临床应用p27基因治疗瘟痕增生提供了实验 依据。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R619.6

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【参考文献】
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