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《第四军医大学》 2002年
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尼古丁对鼠牙胚发育影响的研究

王小竞  
【摘要】: 在烟草的毒性物质中,尼古丁是主要成分。它是烟草中的生物碱,无论是主动吸烟或被动吸烟,作为烟草的活性成分,进入母体血液中的尼古丁可迅速通过胎盘分布,对正在发育的胎儿产生影响。它不仅影响胎儿的全身发育过程,而且干扰了子代颌面部的腭、舌,尤其是牙齿的发育。流行病学调查表明,吸烟可影响子代牙齿发育,动物实验研究也观察到尼古丁可造成牙胚体积缩小,发育迟缓等现象。以往的研究中,人们虽然在形态学方面观察到尼古丁对牙胚发育的影响,但是尼古丁通过何种途径、怎样影响牙胚发育的研究,目前国内外尚未见报道,很有必要深入研究。本研究目的是探讨尼古丁对小鼠牙胚发育的影响和可能机制,共进行了4个部分的13个实验: 1.尼古丁对小鼠牙胚发育影响的形态学研究 选用Balb/c鼠54只,按雌、雄比例3:1同笼,将26只孕鼠分为实验组和对照组,实验组妊娠鼠以1.67mg/kS/d腹膜腔注射尼古丁硫酸盐,注射天数为孕龄6d~20d,在孕龄16d、18d及20d处死动物。从各组胎鼠中选出3~5只行常规组织学制片,HE染色,光学显微镜下观察。从20d孕鼠的胎鼠选出3~5只制做透射电镜标本,电镜下观察。结果,与对照组相比,实验组胎鼠存活数下降,体重减少;光镜下见对照组各组牙胚分别处于其相应的牙胚发育时期,各时期的牙胚发育正常;实验组与相同时期对照组牙胚组织相比体积减小,发育迟缓,细胞数减少,分化程度减弱;电镜下见对照组牙胚细胞胞浆丰富,核仁清晰和线粒体嵴丰满,核内可见到核丝分裂像,而实验组牙胚细胞缩小,核仁不清晰、线粒体肿胀、基质变淡和嵴消失,细胞 第四军医大学博士学位论文 内出现空泡,开始变性。说明,尼古丁抑制了鼠牙胚的生长发育。证实,尼 古丁对胎鼠发育中的牙胚和细胞有一定的毒害作用。 0 2.尼古丁作用下小鼠牙胚发育中烟碱受体表达的研究 在孕龄 16 d、18 d、20 d处死孕鼠,实验组和对照组各取 3—5只胎鼠制 备标本,以人抗烟碱受体抗体行免疫组化染色:取以上各组胎鼠牙胚,分别 提取牙胚组织的蛋白和 RNA,进行 Western blot和 RT-PCR。免疫组化结果 观察到,正常发育的牙胚组织中存在nAChR的表达,尼古丁作用于牙胚组 织后,使发育中牙胚组织 nAChR的表达上调;Western hi仇和 RTFCR结果 表明,正常发育的牙胚组织中存在 nAChR。,蛋白和 dChR a,mRNA;尼 古丁作用于牙胚组织后,可使发育中牙胚组织dChR a,蛋白和nAChR a。 rnRNA表达上调。本部分研究结果在蛋白和InRNA水平证实了正常发育的 牙胚组织中存在dChR,尼古丁作用于牙胚组织后,可上调发育中牙胚组 织dChR蛋白和InRNA的表达,提示,nAChR可能介导了尼古丁对牙胚 生长发育的影响。 3.a-银环蛇毒素对尼古丁作用下小鼠外胚间充质细胞增殖、生长周期及钙 离子浓度变化的研究 本部分研究有5个实验,即:()采用酶消化法建立Balb/。鼠未分化外 胚间充质细胞体外实验模型;(二)采用免疫组织化学方法检测外胚间充质细 胞的 nAChR的表达;D)采用 Mrs法观察在 nAChR桔抗剂 a-Bgt的作用 下,尼古丁对外胚间充质细胞增殖的抑制作用;(4)采用FCM观察在dCbR 桔抗剂阶*寥的作用下,尼古丁作用于外胚间充质细胞后其细胞周期的变化: (5)采用荧光标记示踪法与激光共聚焦扫描技术共用的方法观察在dChR 桔抗剂a习gt的作用下,尼古丁造成外胚间充质细胞内Caz”浓度变化的情况。 3 第四军医大学博士学位论文 结果,()在本实验条件下,培养的的外胚间充质细胞性能是稳定的,可用 于实验:(2)观察到鼠外胚间充质细胞存在nA*hR;(3)尼古丁对细胞增 殖的抑制作用降低;N)尼古丁和 a-Bgt共同作用组可明显升高 s期、降低 G期细胞的百分比,表明,尼古丁对间充质细胞增殖的抑制作用减弱;(5) nAChR g抗剂aEgt可阻断尼古丁造成的细胞内Ca升浓度升高。证实:鼠外 胚间充质细胞存在dChR。推测尼古丁对外胚间充质细胞的作用可能是由 nAChR介导的,nAChR可能介导了尼古丁对牙胚生长发育的影响。 4.尼古丁作用下小鼠牙胚发育中转化生长因于表达的研究 本组实验采用免疫组织化学、Western blot和 RT-PCR的方法,对尼古 丁作用于牙胚组织后TGF p;表达的变化在蛋白和InRNA水平进行了研究。 结果,正常牙胚的各发育时期,在牙胚的内釉上皮细胞、成牙本质细胞和牙 乳头组织中都呈现TGF pl阳性表达,实验组各阶段TGF-el的阳性信号均 较对照组减弱。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R780.2

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