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人白细胞介素4选择性剪接变异体的克隆、表达、纯化及功能实验

遆新宇  
【摘要】: 支气管哮喘是一种由多因素引起的以可逆性气道阻塞、气道高反应性和气道炎症为特征的免疫变态反应性疾病,其中以气道炎症为最主要的病理变化,并决定气道阻塞和气道高反应性的程度。近几年国内外研究者在细胞水平、分子水平和基因水平对哮喘的发病机制进行了深入研究,发现哮喘的发病和诸多免疫细胞、众多细胞因子、多种生物介质以及遗传因素有关。 IL-4是免疫系统中的主要调节因子,其作用包括诱导T细胞向Th2表型转化,活化B细胞合成IgE等。近年研究表明,过敏性哮喘的病理发生离不开Th2细胞的重要作用,而其中IL-4居中心地位。因此,将IL-4作为药物治疗的新靶点为临床上治疗过敏性哮喘开辟了一个新的思路。研究发现,IL-4可选择性剪接IL-4δ2变异体,该变异体是外显子2被删减掉,使外显子1直接和外显子3相拼接,从而产生的只有外显子1、3和4的具有单一开放读框的蛋白。而且,IL-4δ2可以作为IL-4的天然拮抗剂,通过竞争性抑制IL-4与其受体的结合而发挥其抑制效应。 在本实验中,我们首先观察了IL-4δ2在哮喘患者中的表达,结果表明,IL-4δ2在哮喘患者和健康人群中的表达存在显著差异,前者的IL-4δ2表达明显高于后者。在此基础上,我们应用RT-PCR反应技术成功克隆hIL-4δ2基因,同时对其改造,并在大肠杆菌中得到高效表达,表达量占 军四罩 坐俗士公位论文 申文自耍 菌体总蛋白的 30%。建主了包涵体洗涤、复性、常压阴阳离子交换色谱枝 术从大肠杆菌中分离提取表达产物的生产工艺流程,成功的纯化了 h卜4肛融合蛋白。为了降低生产成本及后处理简便易行,引入羟胺切割 位点,拟采用化学裂解手段获得纯品。体外活性实验表明,IL叫62融合 蛋白对几-4促进的T细胞增殖作用具有显著抑制作用,而且其可以显著 抑制B细胞的k 合成和023的表达。


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