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《中国人民解放军第四军医大学》 2003年
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牙胚成纤维细胞生长因子18基因克隆、表达及其功能研究

杨帆  
【摘要】: FGF18是一个新近克隆的FGF家族成员,1998年首次应用PCR方法从鼠胚(E14.5)中分离出来,与FGF8和FGF17属于同一亚家族。研究证实FGF18是一种发育组织重要的分泌性信号分子,在骨骼和软骨的发育中发挥着重要的作用,单纯FGF18的缺失就会严重影响成骨和软骨的形成,那么作为同样具有矿化能力的牙齿,FGF18是否也参与调控其发育和损伤修复的过程呢?本研究带着这个疑问对FGF18在牙胚发育和牙髓组织中的作用进行探索性研究,为今后的研究奠定理论基础和实验依据,具体内容包括: 一、小鼠牙胚FGF18的基因克隆和序列分析 采用异硫氰酸胍一步法从新生小鼠牙胚组织中抽提总RNA,用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA,然后利用巢式PCR技术,根据已公布的FGF18序列,设计一对引物从cDNA中扩增出约621bp的特异片段,将扩增的基因片段插入pGEM-T克隆载体,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,提取质粒DNA,通过限制性酶切进行鉴定并进行核苷酸序列测定。结果表明:成功克隆到小鼠牙胚FGF18全编码区基因片段,序列与GenBank中收录的FGF18cDNA序列一致,初步说明FGF18参与牙胚的发育。 二、FGF18在牙胚发育和牙髓组织中的作用 首先设计一对去除FGF18信号肽基因序列的引物,然后利用PCR技术从 第四军医大学博士学位论文 小鼠牙肛 CDNA中克隆约 524hp的编码区片段,并连人表达载体 pRSETB中, 转化大肠杆菌BLZI(DE3)plySS* IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE凝 胶电泳鉴定,发现在相对分子量为 22KD处出现预计的 FGF融合蛋白表达 条带,经大量诱导表达和 Ni-NTA柱亲和层析纯化,获得了高纯度的 FGF 原核表达产物。以 FGF原核表达产物为抗原,混入完全弗氏佐剂,免疫新 西兰大白兔,将获得的多克隆抗血清经硫酸胺初步纯化后,ELISA实验检测 抗体效价,Western Blot检测抗体的特异性,结果表明成功制备兔抗鼠 FGF 多克隆抗体。 然后采用自行制备的抗体对牙胚发育和牙髓组织中 FGF的时空表达形 式进行免疫组化研究。 l、在牙胚发育中:蕾状期FGF18在成釉器和口腔粘膜上皮细胞表达阳 性,而在周围密集的间充质细胞表达阴性;帽状期在内釉上皮、外釉上皮、 牙胚间充质和牙囊未见阳性表达;钟状早期牙胚,FGF在内釉上皮细胞和 外釉上皮细胞阳性表达,牙乳头细胞弱阳性表达,星网状层和中间层细胞阴 性,牙囊细胞表达阳性,在牙槽骨和软骨中呈阳性表达;钟状晚期,内釉上 皮和外釉上皮分化为成釉细胞和成牙本质细胞,并分泌釉质和牙本质基质, 此时 FGF在具有分泌功能的成牙本质细胞和成釉细胞表达强阳性,牙乳头 细胞和牙囊细胞阳性,星网状层阴性。提示FGF18可能参与牙胚的发生、细 胞分化和基质矿化,但对牙胚的形态发生可能作用较小。 2、在牙髓组织中:正常牙髓成牙本质细胞、牙髓细胞以及血管内皮细胞 中未见有 FGF阳性表达,但在炎症组 FGF在成牙本质细胞和血管内皮细 胞阳性表达,牙髓细胞弱阳性,表明 FGF可能参与牙髓炎症和损伤修复 三、FGF18对牙乳头细胞作用机制的研究 首先设计一对引物,用于构建 FGFIS真核表达载体,利用 PCR技术从新 生小鼠CDNA中克隆540hp的FGF18基因片段,然后将片段连入真核表达载 体psecTagZB 中,构建psecTagZB-FGF18重组质粒,在LipofectAMINEm 2000 4 第四军医大学博士学位论文 脂质体介导下将psecTagZBF 重组质粒转染进哺乳动物细胞COS刁,通 过ELISA方法鉴定COS-7上清中的FGF18真核表达产物。采用MTT法、酶 动力法以及免疫组化方法检测COS-7上清中FGF18对牙乳头细胞增殖、 ALPase以及 1型胶原合成的影响,结果发现 FGF显著促进人牙乳头间充质 细胞的增殖能力(P<0刀5),并增加 ALPase的分泌(P<0刀5,这种作用呈一定 的时间、剂量依赖性,此外F*F18可明显增加细胞1型胶原的合成(P<0刀1), 提示 FGF在人牙乳头间充质细胞的分化和矿化过程中可能起着重要的调节 作用,但它的确切调控机制仍需一些更能模拟体内牙乳头细胞分化过程的实 验加以验证。 综上所述,FGF参与了牙胚的发育,并在牙胚的发生、成牙本质细胞 分化和基质矿化中发挥着一定的调控作用,此外 FGF还参与牙髓炎症和损 伤修复。今后的工作应针对其调控作用的分子机制进行更深入的研究,以全 面揭示 FGFIS的功能作用。
【学位授予单位】:中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R780.2

【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 姜永;成纤维细胞生长因子18对成牙本质细胞分化的作用及信号传导通路的研究[D];第四军医大学;2006年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前9条
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1 包柳郁;人牙髓细胞内Smad2、3在TGF-β1信号转导中作用的研究[D];第四军医大学;2001年
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【共引文献】
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5 李振东;东祁连山高寒草地优势植物内生细菌多样性研究[D];甘肃农业大学;2010年
6 姚小磊;基于TGF-β1与Bcl-2的抗干眼症中药高通量筛选体系的建立[D];湖南中医药大学;2010年
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9 王发明;柚(citrus grandis Osbeck)单染色体AFLP分子标记体系及文库的建立[D];福建农林大学;2010年
10 于蕾;野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡线粒体通路的研究[D];北京中医药大学;2010年
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1 韩秀萍;幽门螺杆菌基因敲除方法的建立及其应用研究[D];华中农业大学;2010年
2 梁斌;一种能同时检测金黄色葡萄球菌A型和B型肠毒素单克隆抗体的制备及特性分析[D];华中农业大学;2010年
3 余姣姣;天蓝放线紫红素生物合成上调基因的克隆及其对阿维菌素产量的影响[D];华中农业大学;2010年
4 郑瑜;银杏核心种质构建初探[D];华中农业大学;2010年
5 黄潘;鸡胚性分化早期性别差异表达miRNAs的鉴定及其特性分析[D];华中农业大学;2010年
6 王萍萍;盾壳霉产孢相关基因的克隆及腺苷脱氨酶(CMADA)基因的初步研究[D];华中农业大学;2010年
7 曹晶;风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达[D];南京医科大学;2009年
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9 高岩;拟南芥fad8基因在烟草叶绿体基因组表达研究[D];哈尔滨师范大学;2010年
10 罗素娟;家蚕细胞周期依赖性蛋白激酶家族(CDK)的研究[D];浙江理工大学;2010年
【同被引文献】
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3 范洪宽,周慧,李惟;成纤维细胞生长因子与其受体相互作用及其抑制剂的研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2001年03期
【二级引证文献】
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1 赵秀;MTA调控人牙髓干细胞分化的分子机制的研究[D];第四军医大学;2010年
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1 孙翰昌;草鱼成纤维细胞生长因子-8(FGF8)的cDNA克隆与序列分析[D];西南大学;2007年
【二级参考文献】
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【相似文献】
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4 记者毛磊;美科学家让鼠肠长出猪牙[N];科技日报;2002年
5 本报记者 董毅然;牙膏能补钙 没有科学性[N];北京科技报;2004年
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4 谢瑞阅;小鼠牙胚裸鼠肌肉异位移植的实验研究[D];山东大学;2006年
5 张丽珊;人类牙胚组织成牙潜能的研究[D];福建师范大学;2014年
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