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《中国人民解放军第四军医大学》 2003年
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血管内皮生长因子变异体基因的构建、表达及表达产物体内诱导自身抗体产生的研究

张聚良  
【摘要】: 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 最早是由体外培养的肿瘤细胞无血清培养基中分离出来的,最初发现它能提高血管的通透性,命名为血管通透性因子(vascular 穷日早巨大学棋士学位征文 permeability factor,pF)。进一步发现,VPP能选择性地促进血 管内皮细胞(。ndothelialcell,EC)分裂,遂命名为血管内皮生长 因子。VEGF是一个大的家族,包括 VEGFtt,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D-D 和胎盘生长因子(placenta rowth factor,PIGF)等,通常所说的 VEGF即指VEGF-A。VEGF的基因位于染色体6PZI.3,全长28kb,编 码VEGF的基因长 14kb,由 8个外显子和 7个内含子组成,VEGF的 CDNA分析提示VEGF蛋白编码存在多样性,8个外显子进行不同的拼 剪产生不同的VEGF表现形式。目前,至少存在5种不同的VEGF分子: VEGF;。;,VEGF;4。,VEGF;。,VEGF;ss和VEGFZ。VEGF;。。由外显子l~5、7 和8编码,可分泌至细胞外间质,但也有相当一部分蛋白质结合于细 胞表面或细胞外基质,在体内丰度最高,目前应用也最广泛。VEGF 由两个亚基形成的同源糖蛋白H聚体,分子量约为45kD.在每个单 体中,N端起始部为由16-24位氨基酸形成的一个口螺旋,中间由4 股 p片层结构组成,包括 pl(27-34)、i 3(51-58)、p 5(73-83) 和 p 6(89-99),其中一端形成脱氨酸结,以一个亚基的第 51位半脱 氨酸和另一个亚基的第60位半脱氨酸组成2条二硫键,连接而形成二 聚体。在还原条件下,二聚体分开形成单体,并丧失所有的生物活性。 VEGF有两个主要的高亲和力受体:Fit-1和KDR,尽管*l的亲 和力高于*R,但几乎所有的促巩活性都是由mR实现的。VEGF是 目前公认的高选择性的EC有丝分裂原,研究表明,VEGF的表达与组 织中的微血管密度密切相关,在体外VEGF可促进EC增殖、移行,体 内可诱导血管生成。业已证实,在几乎所有肿瘤组织中,都有VEGF 的高表达。VEGF的表达与肿瘤的恶性程度、进展、转移及预后呈显 著相关性。因此,以血管生成的各个环节为靶点,通过血管生成抑制 7 Bio’emnowm, Ct FMMU 京日早巨大学低士学位征文 剂来控制肿瘤生长和转移,成为肿瘤防治的一个重要途径。由于血管 生成抑制剂直接作用于增殖的EC,因此抗瘤谱广,也不会造成骨髓 抑制、胃肠道反应或脱发等传统化疗药物造成的毒副反应。而且,EC 作为新生血管的前体,其遗传性状稳定,很少发生变异,不易产生耐 药性。大量实验已经证实,在裸鼠肿瘤模型中,应用VEGF抗体阻断 其促血管生成作用后,可以显著抑制原发肿瘤的生长和转移。但由于 外源性抗体成本较高,不适宜大规模生产,而且抗体本身的免疫原性 也会导致自体排斥反应,影响远期疗效,限制了其进一步应用。 基于这些研究,我们设计了人VEGF;6;的一种变异体,在VEGF;。 的核基末端引入了辅助性T淋巴细胞的抗原表位序列,同时,为了使 此变异体失去促血管生成的活性,我们参考VEGF;。与受体结合的位 点,去掉了 VEGF;。s氨基端的 16位氨基酸。我们将此变异体基因定 向克隆入表达载体 PRSET B中,转化大肠杆菌 BLZI(DE3)菌株,得 到了高效表达。在此基础上,对BALB/C小鼠进行了主动免疫,并接 种腹水瘤细胞 SI 80,建立肿瘤模型,抑瘤实验表明:VEGF;。;变异体可 以诱导产生高浓度自身抗体,抑瘤率达到64.7%,与对照组相比,有 明显差异(P<0.of)。 我们的研究表明,构建的VEGF;。;变异体,失去了促血管生成的活 性,但体内可以诱导产生自身抗体,抑制肿瘤的生长,为肿瘤的抗血 管生成治疗提供了新的手段。
【学位授予单位】:中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R392.1

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