组织工程软骨的构建及修复关节软骨缺损的实验研究

【摘要】： 软骨损伤或缺失是临床上常见的问题，由于软骨的组织学和生物学特性限制了其自身的修复能力，目前尚缺乏有效的治疗措施。组织工程方法为软骨缺损的修复提供了一种全新的手段，利用支架材料为软骨细胞的增殖和基质分泌提供空间架构，形成类似正常软骨组织的结构，并行使功能。本实验研究了无支架组织工程软骨的构建、IGF-1和bFGF对软骨细胞增殖和基质合成及软骨形成的影响，并采用组织工程方法，以聚羟基乙酸和藻酸盐为软骨细胞支架，对关节软骨缺损的修复效果进行了组织学比较研究。 实验一 无支架体外软骨构建的实验研究 目的：观察在无支架条件下软骨细胞体外三维培养的软骨形成能力。 方法：Ⅱ型胶原酶消化法从兔耳获取软骨细胞，低速离心，在离心管底部形成直径约3mm，厚约1mm的软骨细胞团块，加入含10％FBS的DMEM培养液体外培养，分别于4、8和12周中止培养，进行大体观察、组织学和生物化学分析。结果：细胞团块较培养初始体积有增大变化，8周到12周时，外观呈半透明软骨样，HE和阿尔新兰染色显示保持软骨细胞形态，位于软骨陷窝中，陷窝周围及陷窝间有酸性粘多糖合成，Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性表现，GAG含量分析显示软骨细胞保持增殖活性和基质合成能力。结论：软骨细胞团块能够为软骨细胞提供类似支架的三维生长环境，形成软骨样组织。 第四军区大学博士学位论X 实验二 bFGF对软骨细胞增殖和基质形成的影响 ［摘要］目的：观察成纤维细胞生长因子比FGF）对软骨细胞增殖和细胞外基 质合成的影响。方法：酶消化法从兔耳获取软骨细胞，与1．2％藻酸钠混合， 细胞浓度 10’／ml，经注射器滴入 125tnM的 CaCI。溶液，形成软骨细胞／藻酸钙 凝胶微球，用含 10％FBS的 DMEM培养液体外培养，培养液中分别加入 ong／ffil、10ng／thl、50ng／ffil和 100ng／inl浓度的 bFGF。14天中止培养，进行 生物化学分析。结果：ong／ml、10ng／inl、50ng／inl和 100ng／ffil bFGF浓度组体 外培养14天后，单个微球的DNA总量平均为3．4pg、4．7pg、6石卜g和6．spg， GAG平均含量为15．4qg、20石卜g、29．7pg和对．lpg，单位DNA的GAG含 量为4．47、4．39、4．50、4．55pg／pg。结论：bFGF明显促进了软骨细胞的增殖， GAG合成总量也得到明显提高，但单位DNA的GAG合成量无明显变化，表 明bFGF对软骨细胞的影响主要体现在细胞增殖方面。 实验三 bFGF对组织工程软骨构建的影响 【摘要l 目的：复合bFGF和软骨细胞进行裸鼠皮下移植，研究bFGF对体内软 骨形成的影响作用。方法：酶消化法从兔耳获取软骨细胞，与1．2％藻酸钠及 50ng／ml的 bFGF混合，抽入注射器，加入 125InM的 CaCI。溶液，细胞终浓度 5 X 10’／ml，立即行裸鼠背部皮下注射移植，每个部位注射 0．sml，对照组不加 bFGF。分别于3、6周取材进行组织学观察和生物化学分析。结果：6周时， 附加 bFGF组形成成熟软骨组织，而对照组软骨仍处于未成熟阶段，GAG含 量测定显示实验组含量明显高于对照组。结论：bFGF在体内软骨的构建中， 能够促进细胞的增殖和细胞外基质的合成，提高软骨形成速度。 实验四！GFl、bFGF对藻酸盐微球中兔耳弹性软骨细胞增殖活性 和基质合成的影响 【摘要】目的：利用藻酸盐微球体外培养兔耳弹性软骨细胞，观察IGFl、bFGF 对细胞增殖和基质合成的影响及协同作用效果。方法：酶消化法从兔耳获取 软骨细胞，与1二％藻酸钠混合，细胞浓度10’／Inl， 经注射器滴入125InM的 CaCI。溶液，形成软骨细胞／藻酸钙凝胶微球，用含 10％FBS的 DMEM培养液 体外培养，对照组不加生长因子，实验 A、B、C组分别加入 25ng／ml IGFl。 －3－ 第四旱区大学博士学位论文 50ng／ffil bFGF和 25ng／thl IGF＊60ng／thl bFGF，14天后中止培养，采用生物 化学方法分析微球中的细胞DNA和GAG总量。结果：对照组、IGF－l组、 bF份组和K3FK3F－1 ＋b＋bF他组单个微球的DN A总量分别为3．spg、3．6pg、6．2卜g 和6．4pg，GAG含量分别为15．spg、23．spg、29．opg和38．gpg。结论：这项 研究表明IGF－l和bFGF对软骨细胞的影响体现在不同方面，IGF－l可以提高 细胞GAG合成总量，但并不促进软骨细胞增殖，而bFGF主要体现在细胞增 殖方面，IGF．l与bFGF联合应用的协同作用效果明显好于因子的单独应用， 细胞增殖明显，GAG的含量也明显增加，表明不同生长因子的联合应用会产 生更理想的软骨形成条件。 实验五 聚羟基乙酸和藻酸盐复合软骨细胞修复关节软骨缺损的组织学 比较研究 【摘要］目的：比较聚羟基乙酸和藻酸盐复合软骨细胞修复关节骨软骨复合缺 损的效果，探讨组织工程方法修复关节软骨的可行性。方法：酶消化法从成年 新西兰免关节软骨获取软骨细胞，SX10’／ml密度接种到可降解的聚羟基乙酸 支架上或复合