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组织工程软骨的构建及修复关节软骨缺损的实验研究

陈书军  
【摘要】: 软骨损伤或缺失是临床上常见的问题,由于软骨的组织学和生物学特性限制了其自身的修复能力,目前尚缺乏有效的治疗措施。组织工程方法为软骨缺损的修复提供了一种全新的手段,利用支架材料为软骨细胞的增殖和基质分泌提供空间架构,形成类似正常软骨组织的结构,并行使功能。本实验研究了无支架组织工程软骨的构建、IGF-1和bFGF对软骨细胞增殖和基质合成及软骨形成的影响,并采用组织工程方法,以聚羟基乙酸和藻酸盐为软骨细胞支架,对关节软骨缺损的修复效果进行了组织学比较研究。 实验一 无支架体外软骨构建的实验研究 目的:观察在无支架条件下软骨细胞体外三维培养的软骨形成能力。 方法:Ⅱ型胶原酶消化法从兔耳获取软骨细胞,低速离心,在离心管底部形成直径约3mm,厚约1mm的软骨细胞团块,加入含10%FBS的DMEM培养液体外培养,分别于4、8和12周中止培养,进行大体观察、组织学和生物化学分析。结果:细胞团块较培养初始体积有增大变化,8周到12周时,外观呈半透明软骨样,HE和阿尔新兰染色显示保持软骨细胞形态,位于软骨陷窝中,陷窝周围及陷窝间有酸性粘多糖合成,Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性表现,GAG含量分析显示软骨细胞保持增殖活性和基质合成能力。结论:软骨细胞团块能够为软骨细胞提供类似支架的三维生长环境,形成软骨样组织。 第四军区大学博士学位论X 实验二 bFGF对软骨细胞增殖和基质形成的影响 [摘要]目的:观察成纤维细胞生长因子比FGF)对软骨细胞增殖和细胞外基 质合成的影响。方法:酶消化法从兔耳获取软骨细胞,与1.2%藻酸钠混合, 细胞浓度 10’/ml,经注射器滴入 125tnM的 CaCI。溶液,形成软骨细胞/藻酸钙 凝胶微球,用含 10%FBS的 DMEM培养液体外培养,培养液中分别加入 ong/ffil、10ng/thl、50ng/ffil和 100ng/inl浓度的 bFGF。14天中止培养,进行 生物化学分析。结果:ong/ml、10ng/inl、50ng/inl和 100ng/ffil bFGF浓度组体 外培养14天后,单个微球的DNA总量平均为3.4pg、4.7pg、6石卜g和6.spg, GAG平均含量为15.4qg、20石卜g、29.7pg和对.lpg,单位DNA的GAG含 量为4.47、4.39、4.50、4.55pg/pg。结论:bFGF明显促进了软骨细胞的增殖, GAG合成总量也得到明显提高,但单位DNA的GAG合成量无明显变化,表 明bFGF对软骨细胞的影响主要体现在细胞增殖方面。 实验三 bFGF对组织工程软骨构建的影响 【摘要l 目的:复合bFGF和软骨细胞进行裸鼠皮下移植,研究bFGF对体内软 骨形成的影响作用。方法:酶消化法从兔耳获取软骨细胞,与1.2%藻酸钠及 50ng/ml的 bFGF混合,抽入注射器,加入 125InM的 CaCI。溶液,细胞终浓度 5 X 10’/ml,立即行裸鼠背部皮下注射移植,每个部位注射 0.sml,对照组不加 bFGF。分别于3、6周取材进行组织学观察和生物化学分析。结果:6周时, 附加 bFGF组形成成熟软骨组织,而对照组软骨仍处于未成熟阶段,GAG含 量测定显示实验组含量明显高于对照组。结论:bFGF在体内软骨的构建中, 能够促进细胞的增殖和细胞外基质的合成,提高软骨形成速度。 实验四!GFl、bFGF对藻酸盐微球中兔耳弹性软骨细胞增殖活性 和基质合成的影响 【摘要】目的:利用藻酸盐微球体外培养兔耳弹性软骨细胞,观察IGFl、bFGF 对细胞增殖和基质合成的影响及协同作用效果。方法:酶消化法从兔耳获取 软骨细胞,与1二%藻酸钠混合,细胞浓度10’/Inl, 经注射器滴入125InM的 CaCI。溶液,形成软骨细胞/藻酸钙凝胶微球,用含 10%FBS的 DMEM培养液 体外培养,对照组不加生长因子,实验 A、B、C组分别加入 25ng/ml IGFl。 -3- 第四旱区大学博士学位论文 50ng/ffil bFGF和 25ng/thl IGF*60ng/thl bFGF,14天后中止培养,采用生物 化学方法分析微球中的细胞DNA和GAG总量。结果:对照组、IGF-l组、 bF份组和K3FK3F-1 +b+bF他组单个微球的DN A总量分别为3.spg、3.6pg、6.2卜g 和6.4pg,GAG含量分别为15.spg、23.spg、29.opg和38.gpg。结论:这项 研究表明IGF-l和bFGF对软骨细胞的影响体现在不同方面,IGF-l可以提高 细胞GAG合成总量,但并不促进软骨细胞增殖,而bFGF主要体现在细胞增 殖方面,IGF.l与bFGF联合应用的协同作用效果明显好于因子的单独应用, 细胞增殖明显,GAG的含量也明显增加,表明不同生长因子的联合应用会产 生更理想的软骨形成条件。 实验五 聚羟基乙酸和藻酸盐复合软骨细胞修复关节软骨缺损的组织学 比较研究 【摘要]目的:比较聚羟基乙酸和藻酸盐复合软骨细胞修复关节骨软骨复合缺 损的效果,探讨组织工程方法修复关节软骨的可行性。方法:酶消化法从成年 新西兰免关节软骨获取软骨细胞,SX10’/ml密度接种到可降解的聚羟基乙酸 支架上或复合


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