hBMP_2基因转染牙龈成纤维细胞对牙周组织再生影响的实验研究

【摘要】： 牙周治疗的最终目标是实现牙周组织完全功能性再生，其中包括牙槽骨、牙骨质和牙周膜协调一致地、生理性再生。传统的牙周治疗和引导性组织再生技术虽取得一定的临床效果，但总的看来，尚不能达到牙周组织完全再生的目的。组织工程技术引入牙周病治疗的研究领域，为这一目标的实现带来了新的希望。组织工程学研究的主要内容包括种子细胞的来源、生物载体支架的选择以及细胞／载体支架复合体的构建等三个方面。种子细胞的研究是牙周组织工程的重要内容。牙周膜(PDL)细胞是一组具有多向分化潜能的异质性细胞，其中的未分化间充质细胞可分化为成纤维细胞、成骨细胞或成牙骨质细胞，是牙周组织再生的主要细胞。作为种子细胞，PDL细胞具有一定的局限性，它来源有限，须拔除一定量自体牙才能获得，难以在临床上广泛开展。牙龈成纤维细胞作为牙周组织的组成成分，来源丰富、容易获得、具有很强的生长和自我繁殖能力，在适当的刺激下，可表达成骨细胞表型。人骨形成蛋白2(hBMP_2)是BMP家族中诱骨活性最强的一种，也是唯一能单独诱导成骨的因子，在牙周组织再生和修复中具有重要的作用。本研究利用基因转染技术，将hBMP_2基因转染牙龈成纤维细胞，赋予其成骨细胞特性，探讨其在牙周组织再生中的作用，为将其作为理想的种子细胞应用于牙周组织工程提供实验依据。为此，本研究进行了如下几方面的实验： ①将含有pBK-hBMP_2噬菌粒表达载体的大肠杆菌扩增后，以碱裂解法提取pBK—hBMP_2，并进行提纯和酶切鉴定。为以下实验做好准备。 ②利用脂质体将hBMP_2基因转染至人牙龈成纤维细胞中，经G418筛选后获得了稳定表达hBMP_2基因的细胞克隆；在体外培养扩增后，通过原位杂交、免疫组化、夹心ELISA以及转染细胞培养上清液对MC3T3一E1细胞碱性磷酸 第四军医大学博士学位论文2003－05 酶活性和骨钙素合成的影响等检测，从mRNA及蛋白水平证实了稳定转染 hBMP。基因的人牙龈成纤维细胞能够表达具有一定生物学活性的hBMP。。转染 细胞可持续表达有活性的 hBMP。蛋白达 10代以上。 ③在上述实验的基础上，对稳定表达hBMP。的人牙龈成纤维细胞从形态、 增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶活性和骨钙素合成以及体外形成矿化结节 的能力等方面，对其生物学特性进行了观察。结果显示，部分转染细胞由梭 形转化为多角形：细胞倍增时间和细胞增殖周期无明显改变；与未转染细胞 相比，转染细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素合成水平明显升高u的．01h 组 织化学染色表明转染细胞内碱性磷酸酶含量明显升高，并在矿化液作用下形 成矿化结节。结果提示：hBMPz基因转染后人牙龈成纤维细胞生物学特性发 生明显改变，表达成骨细胞表型，具有了某些成骨细胞的特点。 ④将 hBMP。基因转染的人牙龈成纤维细胞与藻酸钙凝胶复合后，进行体 外培养。利用HE染色技术、免疫组化方法和扫描电镜观察细胞在藻酸钙凝 胶中的生物学行为。结果显示，转染细胞在凝胶中呈“悬浮”生长，细胞伸 展良好，并分泌细胞外基质，表达hBMP。。表明藻酸钙凝胶与基因转染的牙 龈成纤维细胞具有较好的相容性。 ⑤将hBMPz基因转染后的自体牙龈成纤维细胞作为种子细胞，与藻酸钙 凝胶复合，植入狗的人工牙周组织缺损区。通过组织学观察和组织学测量， 评价基因转染牙龈成纤维细胞对牙周组织再生的影响，并以未转染的自体牙 龈成纤维细胞和PDL细胞作对照。结果发现：SW后，基因转染的牙龈成纤维 细胞组可见近乎完全的牙周组织再生，未见结合上皮长入、根吸收和骨粘连 等不良愈合方式。未转染牙龈成纤维细胞组有少数牙位出现骨粘连和根吸 收；基因转染细胞组新生牙槽骨、牙骨质以及牙周结缔组织附着量与PDL细 胞组无明显差异（P＞0．05），而比未转染牙龈成纤维细胞组有明显多的牙周 组织再生（P＜0．01）。此结果提示，牙龈成纤维细胞经hBMP。基因转染后可替 一4－ 第四军医大学博士学位论文2003．05 代PDL细胞作为牙周组织工程的种子细胞。 综上所述，本研究利用PBK—hBMP。表达载体成功地将hBMP。基因转入牙 龈成纤维细胞，并使其在细胞内稳定表达；基因转染后，牙龈成纤维细胞可 表达成骨细胞表型；此细胞在藻酸钙凝胶中生长良好，其生物学特性不受影 响；以藻酸钙凝胶为载体，将基因转染的牙龈成纤维细胞应用于牙周组织工 程，可很好地促进实验动物根分叉区人工牙周组织缺损的修复。 本实验结论：外源性的hBMP。基因能够在牙龈成纤维细胞中稳定表达并 促进其向成骨细胞转化；基因转染的牙龈成纤维细胞与藻酸钙凝胶具有良好 的相容性；二者复合可很好地促进牙周组织再生。因此，可以初步认为hBMP。 基因转染牙龈成纤维细胞能作为牙周组织工程的种子细胞。