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《中国人民解放军第四军医大学》 2003年
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以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMA1免疫应答

李珣  
【摘要】: 疟疾仍然是危害人类健康的严重传染病,有效的疫苗将为防止疟原虫感染、减少疟疾发病和阻断蚊媒传播提供重要的手段。DNA疫苗是一种全新的疫苗形式,具有简单、稳定和灵活多样的突出特点,可诱导包括细胞和抗体在内的多种免疫应答。细胞因子在免疫应答过程中具有重要的作用,编码细胞因子的质粒DNA可有效促进和调节DNA疫苗所诱导的免疫应答。用DNA进行初始免疫,用重组蛋白或重组减毒痘病毒进行追加免疫的初始/强化免疫方案可选择性地增强由DNA免疫所诱导的免疫应答,提高DNA疫苗的保护效能。AMA1是红内期疟疾疫苗的重要候选抗原,抗体在针对AMA1的保护性免疫中发挥着关键作用。本研究选择AMA1的胞外域片段作为疫苗靶向,制备了包括重组蛋白、质粒DNA和重组MVA在内的三种不同形式的原型疫苗,在分析各种疫苗免疫特性的基础上,采用DNA加细胞因子编码质粒进行初始免疫,用重组蛋白和重组MVA按不同的顺序进行追加强化,探讨了不同免疫方案在增强小鼠抗AMA1抗体应答中的作用。 首先,自P.f基因组DNA中扩增出编码AMA1胞外域的基因片段,经测序确证后,克隆入原核表达载体。构建了可分别表达AMA1完整胞外域蛋白和不同亚结构域蛋白的系列重组表达载体,包括:pET-16b/E、pET-16b/Ⅰ+Ⅱ、pET-16b/Ⅰ、pET-30a(+)/Ⅱ和pET-30a(+)/Ⅲ。转化E.coli BL21DE3菌,经诱导后表达出各个重组蛋白。用变性剂溶解包涵体蛋白,经Ni-NTA琼脂糖纯化后在适宜的条件下进行重折叠复性。用重组蛋白加福氏佐剂经腹腔接种免疫BALB/c小鼠,制备抗血清,采用免疫荧光和免疫印迹的方法鉴定抗血清的识别特性,用小鼠免疫血清进行疟原虫体外生长抑制实验,分析重组蛋白与保护性抗体应答之间的关系。结果表明,AMA1胞外域蛋白结构的完整性对于保护性抗体的诱导至关重要。 在蛋白免疫实验的基础上,本文选择编码AMA1完整胞外域的基因片段,构建了DNA免疫质粒VR1020/E。用100μg的剂量经肌肉接种BALB/c小鼠,两次免疫后,诱导出明显的AMA1特异的抗体和脾细胞增殖。构建小鼠细胞因子表达质粒pcDNA3/GM-CSF和pcDNA3.1(-)/IL-4,以及双表达质粒pGM-CSF/pTPA-E,用细胞因子表达质粒分别与VR1020/E共同免疫小鼠,分析细胞因子质粒对AMA1 DNA免疫的调节作用。结果表明,各种细胞因子质粒均显著促进了小鼠针对AMA1的抗体和细胞应答, 第四军医大学博士学位论文 摘要 GM(SF质粒和IL人 质粒分别显著促进了ThZ型和hl型的免疫应答。 MVA是高度减毒的痘苗病毒株,利用重组MVA可诱导针对多种病原 体和肿瘤细胞的免疫应答。本文构建了基因转移载体 pllldHR.SSpffi,经同 源重组后筛选获得可稳定表达AMAI蛋白的重组病毒dAVVE。用*~108 TCID”剂量的rMVMi经腹腔接种BALB/c ’J’鼠,三次免疫后诱导出明显 的抗体和脾细胞应答,其抗体应答以IgGZa为主,表明tMWIN诱导了hl 型的免疫应答。 在对三种AMAI原型疫苗的免疫特性进行逐一分析的基础上,本文首 先采用h4VA/E对不同质粒DNA免疫组的小鼠进行了追加强化,结果显示, dAVAi可显著增强DNA免疫所诱导的AMA抗体应答,在提高IgG水 平的同时,更加显著地促进了小鼠的lgGZa应答。同时发现,DNA初始免 疫的应答水平、应答类型以及免疫间隔时间对病毒强化免疫的效果具有一 定的影响。初始应答的抗体水平与强化免疫后的抗体水平呈正相关。由 GM(SF表达质粒诱导的ThZ型应答在病毒强化后依然占据主导,而由 IL-12表达质粒诱导的hl型应答在病毒强化后则得到了进一步的加强和 巩固。较长的免疫间隔有利于产生更高水平的回忆性抗体,同时也更加倾 向于病毒所诱导的免疫应答即hl型应答。 在进一步的实验中,本文采用 VR1020N加 GM.CSF表达质粒对小鼠 进行了初始免疫,而后用重组蛋白和重组MVA按不同的先后顺序进行了 组合强化免疫,对比分析不同免疫强化方案在增强小鼠抗体应答中的作用。 结果表明,重组蛋白E加福氏完全佐剂和rMVA/E可同样显著地强化DNA 诱导的抗体应答,蛋白强化更加显著地促进了IgGI类抗体,病毒强化则更 加显著地促进了IgGZa类抗体。重组蛋白E加福氏完全佐剂在fAVAjE强 化的基础上进一步提高了小鼠的IgG水平,并显著地增强了IgGZa应答。 以上研究结果为探索以AMAI为应用抗原的红内期疟疾疫苗的最佳免 疫方案提供了实验基础。
【学位授予单位】:中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R392

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