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《中国人民解放军第四军医大学》 2003年
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一种新型超声造影剂JD-95介导血管内皮生长因子基因治疗心肌缺血的实验研究

于铭  
【摘要】: 本研究着眼于将超声造影剂从诊断技术拓展为用作载体、介导、辅助治疗的新方法,并进行了一系列有益的探索。首先构建了血管内皮生长因子与增强型绿色荧光蛋白基因共表达载体,实验了一种新型超声造影剂JD-95经静脉实时造影的可行性。然后进行了超声造影剂JD-95介导血管内皮生长因子基因治疗心肌缺血的体外和体内实验,简述如下。 第一部分一种新型超声造影剂JD-95实时器官显影的实验研究目的一种新型超声造影剂JD-95的实时器官显影效果及其安全性的检测。方法6只实验犬以微量注射泵静脉滴注0.1ml/(kg·min)至0.3ml/(kg·min)不同剂量新型超声造影剂JD-95,进行实时心肌、肝脏、肾脏声学造影,监测心率、左室收缩功能及血气指标。结果该声学造影剂能显示良好的图像,心率、左室收缩功能及血气指标均未见明显变化(p>0.05)。结论新型超声造影剂JD-95可以获得良好的心肌、肝脏、肾脏声学造影效果,对实验犬无影响。 第二部分VEGF真核表达载体的构建及在内皮与心肌细胞内的表达 目的探讨外源性VEGF165基因在内皮细胞与心肌细胞内表达的可行性。 方法构建了血管内皮生长因子与增强型绿色荧光蛋白基因共表达载体 pIRESZ-EGFP-hVEGF165,以脂质体法转染内皮细胞和心肌细胞,采用荧 光显微镜检测内皮细胞与心肌细胞中绿色荧光蛋白的表达,同时利用免疫 组织化学方法检测血管内皮生长因子的表达。结果成功地构建了真核表 达载体pIRESZ-EGFP-hVEGF165,采用脂质体法转染内皮细胞与心肌细胞 后,经荧光显微镜观察,可见细胞内有绿色荧光蛋白的表达,同时经免疫 组化证实有血管内皮生长因子的表达。结论采用脂质体法可以成功地将 外源性VEGF165基因转染到内皮细胞与心肌细胞中,并进行表达,本研究 为今后利用VEGF基因治疗心肌缺血等疾病提供了实验基础。 第三部分超声破坏微泡造影剂介导VEGF基因转染的体外实验 目的研究超声破坏微泡造影剂的方法提高脂质体介导的VEGF基因在内 皮细胞中转染率的可行性。方法脂质体介导VEGF基因转染l小时后,将 6孔板中的内皮细胞每孔加入造影剂10PL或100VL或500vL,然后暴露在 超声下 30秒、60秒、90秒。超声探头(Sonos 5500,S3,1.3MHz,MI.0) 置于水槽中,距离培养板 Icm。2天后,用荧光显微镜观察标记基因 EGFP 的表达。结果超声照射细胞30秒和 60秒,EGFP基因表达显著提高,照 射90秒时杀死了大多数细胞。每孔加入微泡造影剂100PL时,其在超声 作用下产生的空化作用提高了基因转染效率,造影剂为500PL时,细胞死 亡率较高。结论超声破坏微泡造影剂可以提高脂质体介导的基因细胞转 染效率,为今后治疗基因的体内转染提供了经验。 第四部分超声破坏微泡造影剂介导VEGF基因心肌转染的动物实验 目的探讨超声破坏微泡造影剂介导VEGF基因转染兔子缺血心肌的有效 一3一 性。方法结扎兔子冠脉左旋支,建立急性心肌梗死模型。术后3天,将 基因和造影剂混合物经耳缘静脉输入兔子体内,同时给予超声照射心脏缺 血区。其它对照组包括超声和造影剂,单独基因,基因和超声,基因和造 影剂以及空白对照组。2周后,处死动物,用免疫组化方法检测VEGF蛋 白表达。结果在超声破坏造影剂介导基因转染的实验组中有5只动物的 心脏缺血心肌中有VEGF蛋白的表达。而其它对照组中无VEGF蛋白表达。 结论超声破坏造影剂微气泡的方法是将体外生物活性物质传递至心肌中 的一种有效途径。
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