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组织特异性CD/5-FC系统对大肠癌细胞杀伤作用

黎成金  
【摘要】: 目的 探讨CEA组织特异性CD/5-FC系统对低表达CEA的大肠癌肿瘤是否具有靶向性杀伤作用,这种靶向性杀伤作用对不同CEA表达水平的大肠癌细胞有无差异。 方法 将质粒pCD2,G1CEACDNa在感受态中大量扩增后,质粒pCD2用BamHⅠ及EcoRⅠ酶切鉴定,质粒G1CEACDNa用SalⅠ酶切鉴定,用PA317细胞包装,以孔径为0.45um的滤膜过滤培养液以获得病毒上清,用Hella细胞接种计算病毒滴度。脂质体法转染大肠癌细胞,以含G418的RPMI 1640培养基选择培养,在96孔细胞培养板中进行前药5-FC对转基因大肠癌细胞的杀伤作用实验,MTT法测定活细胞比率并计算杀伤率。之后,接种Balb/c裸鼠大腿外侧皮下,观察成瘤情况,待裸鼠成瘤2周后,每天腹腔注射500mg/kg的5-FC,观察肿瘤生长情况,前药治疗21d,肿瘤标本称重后取少量组织行验证实验,制成石蜡切片,在显微镜下观察肿瘤病理学变化。在此基础上进行原位基因治疗实验。提取细胞基因组DNA行PCR检测,检测目的基因的整合情况,提取组织总的RNA,RT-PCR来检测基因的表达情况。 结果 第四军医大学博士学位论文4 pCDZ用 BamH及EcOR酶切鉴定,可见 1.skb阳性克隆,GICEACDNa 用 Sal酶切鉴定,可见 1.gkb阳性克隆,脂质体法将pCDZ、GICEACDNa直 接转染入大肠癌LoVo细胞及SW480细胞,PCR证明目的基因整合到靶细胞中, 铺96孔板进行前药治疗后,第刀小时可观察到转基因细胞出现收缩及变形, 第 5天部分细胞出现崩解死亡,以转 GI CEACDNa基因之 LoVO细胞最为明显, 5FC对转基因大肠癌细胞oVO,SW480有杀伤作用,转CD基因之oVo, SW480细胞对5FC的敏感性明显提高,转GICEACDNa之LoVo细胞较转pCDZ 之LoVo细胞对5IC的敏感性明显增强,其IC。。分别为0.lrTun。l/L和0.8 nunol/L,而转GICEACDNa之SW480细胞对5FC的敏感性与转pCDZ之 SW480细胞无显差别,其 ICs。分别为回刀 nunol/L和 0.8 frunol/L。表明在组 织特异性转录调控序列 CEA TRS驱动下,胞啼陡脱氨酶基因对高表达 CEA的 大肠癌细胞杀伤作用更强。重组逆转录病毒pCDZ及GICEACDNa经PA317细 胞包装后,其病毒滴度分别为:7.5川允FU几及 5石X10七FU/L。将转基因瘤 细胞皮下注射2周后,在注射部位均可见肿瘤生长,前药5*C治疗3Wb后, 在oVo细胞肿瘤,转pCDZ及GICEACDNa基因组肿瘤较未转基因组肿瘤明 显缩小(P<0.of,t =4.512,n二5;P<0刀1,矿一3.320,n二5),GICEACDNa 阳性组比 pCDZ阳性组作用更为明显(P<0.05,t-2.375,n-5)。在 SW480 细胞肿瘤,转 pCDZ及 GI CEACDNa基因组肿瘤较未转基因组肿瘤明显缩小 P <0刀1,t=4.547,n—5;P<0刀1,t =4.475,n—5),但 GICEACDNa阳性 组的抑瘤作用并不优于休*2基因阳性组(P>0刀5人镜下观察发现,在Lo VO 结肠癌细胞肿瘤组织,对照组肿瘤细胞生长活跃,并可见核分裂相及瘤巨细胞, 而转基因组标本中肿瘤细胞减少,细胞空泡变性,特别是转 GI CEACDNa基因 的标本内,仅残留极少量肿瘤细胞,并可见散在成纤维细胞及炎细胞:在S WW480 结肠癌细胞肿瘤组织,对照组肿瘤细胞生长活跃,可见核分裂相,转pCDZ基 因及GICEACDNa基因的标本内,可见细胞大片空泡变性,灶性坏死,炎细胞 浸润,以转 GI CEACDNa基因的肿瘤组织更为明显。原位转基因治疗后,亦观 第四军医大学博士学位论文5 察到相似的结果。通过RTPCR检测表明目的基因整合到靶细胞后,在肿瘤组 织能稳定表达。 结论 1 脂质体法及逆转录病毒感染法均能成功转染质粒GICEACDNa及pCDZ, 目的基因在组织中均能稳定表达 2 重复感染对提高逆转录病毒的基因转染率有益 3 用CEA转录调控序列启动子调节胞啼促脱氨基酶的表达,对CEA阳性的 大肠癌肿瘤有靶向性杀伤作用 4 用CEA转录调控序列启动于调节胞啼吱脱氨基酶基因的表达,对高表达 CEA的大肠癌组织杀伤作用更好 5 用CEA转录调控序列启动子调节胞啼咳脱氨基酶的表达,对低表达CEA 的大肠癌组织的靶向性杀伤作用效果有限


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