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TRP-1在正常黑素细胞及恶性黑素瘤细胞中的作用研究

李春英  
【摘要】: 酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein 1,TRP-1)是黑素细胞和恶性黑素瘤细胞中含量最丰富的糖蛋白,其基因是第一个克隆成功的色素基因。由于该蛋白与酪氨酸酶有一定的同源性,因而被称为酪氨酸酶相关蛋白—1。多年来人们对人TRP-1的功能一直有争议。近来通过对鼠TRP-1功能的研究,证明该蛋白具有5,6-二羟吲哚羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid,DHICA)氧化酶活性,在黑素合成的下游途径中起重要作用。但研究表明DHICA不是人TRP-1的底物,此外,一些研究观察到黑素细胞在抗氧化压力能力下降、早死的同时伴有TRP-1基因表达的异常。因此推测TRP-1与黑素细胞的变性和死亡相关,也参与黑素形成过程中系统毒性物质的清除,但是至今尚无直接的证据,TRP—1的功能仍有待于进一步的研究。 尽管国内外缺乏这方面的研究,但已发现黑素细胞中发生的某些分子事件与TRP-1有关,把黑素细胞和恶性黑素瘤(malignant melanoma,MM)细胞暴露于UVB下,细胞的酪氨酸酶活性增强,黑素合成增加,TRP-1的mRNA和蛋白表达提高。而从白癜风患者的病变边缘取材建立人黑素细胞系,其黑素细胞同正常黑素细胞相比具有较大的核周 第四军医大学俗士学位论文 一 质及短而粗的树突,在MTT实验中表现为异常反应,当暴露于紫外 线或受到热休克而使细胞氧化张力增加时,表现为细胞早期死亡,同 时检测到Tny-lmRNA的降低。在白缀风的移植治疗研究中,有学者 发现高浓度的角质形成细胞会抑制黑素细胞TRP-1 的表达,同时导致 移植黑素细胞的消失,这些现象提示TRPl在调节黑素细胞生长和维 持细胞自身稳定等方面发挥重要作用。TRP-1 不仅参与黑素的合成代 谢,也参与黑素形成过程中系统毒性物质的清除,影响黑素细胞的增 殖和死亡【‘-‘’]。但是由于目前对其功能的认识还非常有限,有些推论来 自于对实验现象的解释,还没有直接的证据证明以往观察到的现象是 “因”还是“果”。 本研究旨在克隆TRP-l编码基因的。DNA序列,并构建其反义真 核表达载体及稳定表达的小干涉 RNA(small interference RNA,siRNA) 载体,通过基因转染,在黑素细胞和恶性黑素瘤细胞中封闭TRPq表 达,观察其生物学行为的变化情况,以探讨TRP刁表达在黑素细胞及 恶性黑素瘤细胞中的作用。主要实验方法及结果包括: 一、T旺l编码基因的克隆及其反义核酸转染的正常黑素细胞及 恶性黑素瘤细胞株的建立 利用同位酶进行亚克隆,将目的基因反向亚克隆至真核表达载体 pCDNA3.1,构建其反义真核表达载体PCDNA3.1汀nyl(-)并进行酶切 鉴定。脂质体介导反义重组载体及空载体分别转染Tgn刁高表达的人 正常黑素细胞及人黑素瘤细胞系Libr,各种细胞分别命名如下:TRP 反义核酸转染的黑素瘤细胞几ibr Tny上,Libr-AS人空载体转 染的黑素瘤细胞(Libf今CDNA3.l,LibfP人 TRpl反义核酸转染的黑 素细胞(melanocytes TRP上,MC-AS)及空载体转染的黑素细 ·3· 第四军医大学傅士学位论文 胞(melanocytes-pcDNA3.1,MCP) RT一PCR及 Western blot证%: 在TRP.l反义核酸瞬时转染的人黑素细胞及稳定转染的人黑素瘤细胞 系Libr中Tny刁的蛋白及mRNA水平均下调。Tny-1反义核酸转染的 人正常黑素细胞及恶性黑素瘤细胞株方法建立成功。 二、TRP-l表达与正常黑素细胞及恶性黑素瘤细胞细胞生物学行 为的关系研究 在黑素细胞和恶性黑素瘤细胞中封闭Tnyl表达后,我们观察了 包括细胞增殖与凋亡、黑素合成功能及细胞形态学等方面的细胞生物 学行为的变化情况。 1.Tny-l反义核酸对正常黑素细胞及黑素瘤细胞增殖与凋亡的影响 Libr-AS与 Libr-P;MC叭S与 MCP分别行 MTT比色试验,依据 测定的A490值,绘制生长曲线。Tny-1反义核酸转染的黑素细胞和黑 素瘤细胞分别在细胞生长曲线中显示增殖速度低于亲本细胞。MC-P。 MC—AS和 MM-AS、MM-P洗涤固定染色后,以流式细胞仪测定细胞 DNA含量,分析细胞周期的改变。结果显示反义核酸转染的黑素细胞 及黑素瘤细胞发生了明显的 GI期细胞周期阻滞。接种 1000个充分消 化的对数生长期的Libr-AS及Libr-P,出现肉眼可见克隆时染色后并计 数克隆数,TRPl反义核酸转染的黑素瘤细胞克隆形成率显著降低。 电镜观察转染细胞的超微结构,可见凋亡小体:转染细胞无血清培养 饥饿 48小时后以 PI和 Annexin双重标记,经流式细胞仪检测发现转染 的黑素细胞及黑素瘤细胞凋亡明显高于对照细胞,与转染的黑素瘤细 胞相比,转染黑素细胞凋亡和死亡都更加明显。每组三只裸鼠,取对 数生长期的转染组细胞Libr-AS、对照组Libr-P及未转染的细胞Libr 各 4X 10’,接种于裸鼠背部皮下。30天后,三组裸鼠移植瘤平均重量 ·4· 第四军医?


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