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《中国人民解放军第四军医大学》 2003年
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核基质MINT N端片段(365-1084 aa)相互作用蛋白的筛选及鉴定

秦红  
【摘要】: Notch基因编码的信号受体在调节无脊椎动物和脊椎动物的发育上起着决定细胞命运分化方向的关键作用。Notch受体是异源二聚体,为跨膜信号蛋白,胞外区结构包括信号肽、36个EGF(表皮生长因子)样重复序列和三个膜近端的Lin12/Notch/Glp-1(LNG)重复序列。其胞内段从近膜处依次是Su(H)(RBP-JK/CBF-1在果蝇中的同源物)结合区(RAM23结构域)、cdc10/ankyrin重复序列、转录激活区和PEST富集区结构域。当Notch受体与其配体Delta或Serrate(在哺乳动物中为Jagged)结合后,胞内段被 与其配体Delta或Serrae(在哺乳动物中为Jagged)结合后,胞内段被 Presenilin.1 样蛋白水解酶从近膜处水解掉,胞内段转位进核并通过KAM23 结构域和odelo/川切in重复序列同DNA结合蛋白Su()iBPJ 转录 因子相结合。当NOtCh的胞内段结构域同SO(H)/RBPJ 八结合后,NOtCh 的胞内段取代了与SU(团用旧FJ K/K/**卜1相结合转录阻遏复合物,并激活 *成h下游靶基因的转录:当*成h的胞内段结构域不同hm雌卜JU*B卜1 结合时,SUm朋卜Jw*SFI可通过募集组蛋白去乙酚化酶m**q抑制转 录,因此SU(m/RB卜JK/**FI是NN吮信号途径上起着转录调控作用的关键 分子。MINT/spen基因编码的核蛋白从线虫到人类均高度保守,MINT/spen 蛋白是转录抑制复合物,作用于蛋白去乙酚化酶复合物,并通过抑制 SC门yRBP刁 而对NOtCh信号途径起着负调控作用。为了进一步研究 MINT与Sll(H*RBP* 相互作用的机理,韩驿教授同日本H.HOfij。研 究室一道建立了MWIT的基因剔除小鼠并获得了成功,MINT基因剔除小鼠 初步表型分析见纯合子MpoT突变小鼠胚胎在发育至约13.sdpC时死亡,组 织病理学观察见纯合子突变胚胎有明显的中枢神经系统发育障碍,提示 MINT参与小鼠中枢神经系统的发育。MtwT基因剔除小鼠获得成功后,我们 进而利用酵母双杂交的方法来筛选与MINT相互作用的蛋白质,鉴于 MWTcDNA较长,有 10799个碱基,因此将其分为 6个片段,分别命名为 FIf6。本研究将其中MINTFZ(编码365q 位氨基酸)插入pGBKT7载 体中,以此为诱饵质粒从小鼠胚胎9天的CDNA文库筛选了与MINTFZ片段 相互作用的蛋白。经过营养筛选及p-半乳糖苦酶活性分析,结果筛选到了128 个阳性克隆。并提取质粒进行酶切鉴定,最后获得4个非重复克隆,对此4 个非重复克隆进行序列分析结果得出:它们分别是:层劲连蛋白受体1,2个 16s核糖体RNA和精氨酚-tRNA合成酶。 本研究筛出的 2个 16s核糖体 RNA均为线粒体 RNA,l个在线粒体膜上, 为同胎生哺乳动物的起源与分化有关的分子,其具体的作用机制还需进一步 探讨;另一个在核内,为嵌合线粒体 RNA,是 16s线粒体 RNA 5’末端共价 连接一个 120hp的反向重复序列,是转录后产物,可能是反式剪切后的结果, 广泛分布于鼠的精于、辜丸、肝、肾、脑和脾。本研究还筛出了1个精氨酚 .tRNA合成酶,它的作用是将tRNA与精氨酸结合。另外还筛出了一个层新 连蛋白受体1,为一个高亲和力的并高表达于各种肿瘤细胞表面乃白血病)的 蛋白受体,它同层猫连蛋白1结合后,改变层猫连蛋白1构型从而使其结构 域与肿瘤细胞分泌的特异的蛋白酶(主要是半眺氨酸蛋白酶组织蛋白酶B) 相结合,加快了层猫连蛋白1降解的速度并释放其蛋白水解的片段,从而加 快了肿瘤细胞的扩散。至于层猫连蛋臼受体1同MWTFZ相互作用的机制还 需进一步探讨。 总之,目前己知 MINT是在N。eh信号途径上,同 N。t。h分子竞争结合 SC(H丫RBPJK,对NOtCh下游基因的转录激活起抑制作用,MINT是个转录 抑制分子,但它的转录抑制作用机制目前还不清楚,还需要进一步的研究。 本研究通过酵母双杂交的方法筛出的这4个与MWTFZ相互作用的分子,为 进一步研究MINT的功能打下了基础。
【学位授予单位】:中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R346

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