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《中国人民解放军第四军医大学》 2003年
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反义硫代寡核苷酸逆转MRSA耐药性的研究

扈本荃  
【摘要】: 伴随着抗生素的广泛应用,细菌耐药在当今世界范围内的产生和蔓延已愈演愈重,许多曾经是可治愈的疾病,如细菌感染、败血症、传染性疾病正在成为难以治愈的疾病。耐药细菌金黄色葡萄球菌是耐药性发生率最高的致病菌。WHO发布的金黄色葡萄球菌耐药性监测报告显示,世界范围内对青霉素G耐药的金黄色葡萄球菌株已达90%,其中耐药性更强的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methecillin—resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的发生率已达60%-70%或更高,医院内MRSA感染患者的死亡率最高可达50%。由于MRSA对所有β-内酰胺类抗生素耐药且呈多药耐药,寻找和研制能有效控制耐药菌的手段和药物已成为当务之急。本课题针对MRSA采用反义技术阻断其耐药基因的表达,逆转MRSA的耐药性。 一菌株的鉴定 从国家耐药性监测中心获取MRSA菌株WHO-2,质控菌株ATCC25923由中国药品生物制品检定所提供。使用Microscan WalkAway-40全自动微生物鉴定系统对菌株进行种属鉴定:细菌耐药性 第四军医大学硕土研究生论文 采用琼脂扩散法和琼脂筛选法鉴定;利用PCR扩增技术检测MRSA耐 药基因meCRj。鉴定结果:WHO2 为金黄色葡萄球菌,鉴定率 id-99.99%;WHO工在苯哇西林门 g/片)药敏纸片作用下无抑菌圈, 其直径以药敏纸片的直径计算,为6nun;琼脂筛选法鉴定MRSA菌株 WHO.2的结果显示,WHO-2含苯哩西林的琼脂培养板表面仍有菌落生 长。PCR扩增产物检测到特异性耐药基因序列mecRI。质控菌株的结果 说明,本实验中所有的鉴定方法均符合NCCLS标准。提示WHO上是 一株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,并携带本研究的目标靶基因 mecR 二 反义寡核苦酸的设计和合成 在基因库内挑选 MRSA meCRI的 DNA序列,BLAST软件分析该 基因序列,利用RN Ar计算机程序辅助设计反义寡核昔酸,挑选 出三条各项参数均较理想的的反义寡核昔酸,并合成全硫代修饰的反义 寡聚脱氧核昔酸。三条反义寡聚脱氧核昔酸的作用位点和序列见表1: 表1 设计合成的反义脱氧寡核苦酸序列 反义寡核昔酸 作用位点 核酸序列 Oligl 108~122位AACCWC17AI’GT OligZI 92—207位 CGATTCATCATATCT Olig3 130~149位GGAAWhCGTGGAGACGAG 三 反义寡核昔酸对MRSA耐药性的影响 采用电穿孔技术将反义寡核昔酸*00ng)导入细菌O”勺体内。调 节电穿孔仪,使电脉冲为 25 11F,电压为 900 V,时间为 5 ms,进行电 击。穿孔后观察反义寡核昔酸对 MRSA在含苯哇西林“ 11 g/ ml,18 .4- 第四军医大学硕土研究生诏文 pg/Inl)的肉汤培养基中生长曲线的影响,对MRSA在含苯哇西林“ P g/ ml)的 M-H琼脂培养基表面菌落生长的影响以及对 MRSA抑菌圈 的影响。结果为;35oC培养时,Oligl、OligZ可使MRSA在含苯哇西林 的培养基中MRSA生长曲线较对照组(未加反义寡核苦酸)的生长曲 线下移,olig3对 NDISA的生长曲线无影响;含苯哇西林“ u g/ Inl) 的 M-H琼脂培养基表面,oligl、oligZ组的菌落数明显低于对照组(n==9, P<0刀5 vs对照组人olig3组的菌落数与对照组无明显差异(n=9,P>0刀5 VS对照组人在苯哇西林药敏纸片门 g/片)作用下,Oligl、OligZ组 在药敏纸片周围出现抑菌圈,而Olig3组与对照组在药敏纸片周围无抑 菌圈出现。提示Oligl、OligZ可有效逆转MRSA对抗生素的耐药性。
【学位授予单位】:中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R96

【参考文献】
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