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《中国人民解放军第四军医大学》 2003年
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抗GbpA-GBD单克隆抗体的制备及特性研究

王小勇  
【摘要】: 龋病是三大非传染性疾病之一,发病广,危害大。变形链球菌族(MS)是目前公认的致龋菌,其中与人类龋病发生关系密切的是变形链球菌(S.mutans)和远缘链球菌(S.sobrinu,又称茸毛链球菌)。MS在牙面的粘附、增殖是其致龋的基础。目前防龋研究主要围绕链球菌在牙面的粘附、聚集及增殖几个环节进行,介导MS在牙面粘附、聚集的毒力因子主要有表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ(AgⅠ/Ⅱ)、葡糖基转移酶(GTFs)及葡聚糖结合蛋白(Gbps)。AgⅠ/Ⅱ、GTFs及GbpB在免疫防龋中具有明显的保护性防龋作用,GbpA在氨基酸序列上与GTFs的葡聚糖结合区(GBD)高度同源,但其GBD在被动免疫防龋中的作用尚未见报道。由于被动免疫避免了主动免疫时可能出现的与宿主组织的交叉反应及其它副作用,直接作用于口腔,因此易被人们接受,受到越来越多的关注。 第四军医大学硕士学位论文 一 本研究分为两个部分: 一、分泌抗GbPAGBD单克隆抗体细胞系的建立 主要实验内容包括: 1.杂交瘤细胞系的建立:以GBD为抗原,免疫Balb/c /J’鼠,通过B淋巴 细胞杂交瘤技术,即用B淋巴细胞与骨髓瘤细胞驼/0进行细胞融合,经 筛选和克隆化后,间接ELISA法检测杂交瘤培养上清中有特异性抗体分泌 后,建立杂交瘤细胞系。 2.杂交瘤细胞特性分析:用秋水仙素阻抑法对杂交瘤细胞特性进行染色 体数目分析。 3.效价测定及Ig类别鉴定:用琼脂糖凝胶双向扩散法检测抗体亚类。并 检测腹水效价。 4.单克隆抗体的纯化:用饱和硫酸铰盐析法,对单克隆抗体进行纯化。先 后共融合2次,克隆生长率为100%,阳性率为35%,经过2上次克隆化, 获得了 6株稳定分泌抗GBD的杂交瘤细胞系,分别命名为 2C9jC5J。 3H6、4C9和4FIO,在体外连续培养传代,液氮冻存半年以上,复苏后生 长良好,分泌抗体性能稳定。染色体数目分析结果显示:2C9染色体数为 107.6土3.4条,3C5为 102.2土2.l条,3GI、3H6、4C9和4F10分别为 106.8 i 2.2、102.4 i 3.6、107.ZIZ.7、105.6 i 3.3。说明各细胞系均为融合细胞。 5.ELISA检测抗体效价,六株McAh的腹水效价均为 IX10“‘。2C9、3C5。 3GI和 4C9亚型为 IgGI,。链;3H6和 4F10亚型为 IgGZa,K链。 3 第四军医大学硕士学位论文 二、抗GbpA*BD单克隆抗体特异性鉴定及相应抗原初步分析 1单克隆抗体的亲和常数:采用间接ELISA法测定MCAb亲和常数。 2 GBD单克隆抗体 Western blot免疫印迹杂交 3免疫组织化学染色 从亲和常数可知 3C5、3H6和 4F10的亲和力大于 2C9、4C9和 3GI的亲 和力。Western blot免疫印迹杂交结果显示,3C5、3H6和 4F10在分子量 43KD 处出现明显的兔疫反应条带,而阴性对照组、空白对照组无阳性条带,2C9。 4C9和3GI在43KD处出现弱阳性条带。至少有3株单抗能够识别变性的 GBD蛋白,证实了单抗的特异性,同时也表明此6株单抗识别空间表位有 所差异。免疫组织化学染色检测结果发现,6株单抗在S,nutans胞壁染色均 呈阳性,进一步证实了其特异性。
【学位授予单位】:中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R780.1

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