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《中国人民解放军第四军医大学》 2003年
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multi-PCR-SSCP检测耐异烟肼结核分支杆菌方法建立和初步临床应用

程晓东  
【摘要】: 结核病(tuberculosis,TB)是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一种以肺结核最为常见的慢性传染病。近年来,全球结核病疫情回升,结核病依然是一个全球性的、严重的、需要高度重视的公共卫生问题和社会问题。 化疗是治疗结核病人、控制和消灭传染源的最主要手段。但由于耐药结核菌,特别是多重耐药结核菌的增加,严重影响了结核病的化疗效果,给结核病控制带来了极大的困难,故药敏试验也变得更为需要。传统的药敏试验所需时间长,使耐药菌在局部扩散,加之痰培养的阳性率较低,在临床上很难常规应用。因此,结核分支杆菌耐药性的快速检测对结核病的早期有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。近年随着分子生物学的发展,用基因技术对结核菌进行诊断和药敏试验,开辟了新途径,并取得了可喜成绩。用于结核杆菌耐药基因检测的技术很多,相比之下,单链构象多态性分析(Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP)不失为一种较好的方法。SSCP可检测耐药基因点突变和短序列的缺失、插入,不需特殊仪器,具有 第四军医大学可士学位论文 快速、操作简便、费用低,敏感和特异性均高的忧点。 异烟姘门s。niAf此IN H )是治疗结核病的主要一线药物之一,故结核分 支杆菌对异烟肘耐药的问题备受关注。揭示结核杆菌耐异烟肘的机制,建立 一种对临床分离株乃至临床标本进行快速检测耐药的手段,是临床迫切需要 解抉的问题。目前虽有PCR-SSCP检测耐异烟朕基回的报道,但不能一次检 出多数量的耐药基因,从而使目前标准的化疗方案治疗夫败。为此,本课题 的主要研究内容为:在进行结核杆菌标准株和临床分离株培养和药敏试验的 基础上,建立一种对与耐异烟朕密切相关的p hC启动子、nln、[凯G基回 新的分于药敏试验方法,即多重PCR-SSCP检测方法,并与测序结果相比较, 参照药敏结果,探讨该方法的实用性和可行性。 一、multiPCR方法的建2 已证实,编码过氧化氢-过氧化物酶的katG基因突变,是导致结核分支 杆菌耐异烟朕的主要原因,但又不能完全解释这一现象。近年研究表明,inhA 和 aphC启动于基因突变都与结核菌耐异烟姘有关,且这三个基因突变己被 证实在幻%以上的结核菌耐异烟肘突变。为此,本研究使用Primerior nay 公司的多重引物设计软件,成功的设计了aphC启动于、inhA、katG这弓个 基因的6条引物,对所选基回通过合理选择扩增区域及长度,尽可能多的涵 盖耐药基回突变位点,以期一次扩增出幻%以上的结核分支杆菌耐异烟盼基 回。引物序列为:aphC启动子基回特异性引物根据 Genbarili:UI 6243的序列 自行设计,扩增片段为 311 hp,引物序列为:A。 5’-GGT G八 AGT GGT GAA GTA GTC G-3’A。5’-CTT GCG GCA CTG CT”G AAC-3’;inhA基回特 异性引物根据GenbanLk:U02492白序歹自行 设计,扩增片崭为395hp,引物序 歹u为:IS’-TCC八CA TCT CGG CGT ATT CG-3’I。5’-CGG CAG CCA GTC AGA CAG-3’;k;tG基回特异性引物根据 EMBL:X6808的序列 E门于 设计,扩增片段为458hP,引物序列为:K。5’-CGG CGA TOA GCG T”TA CAG-3’K;.5’-(:GT CCT TGG CGG TGT ATT-3’。首先 对结卞亥分支杆菌 -4- 第四军医大学硕士学位论文 H37RV标准株和 58株临床分离株进行增菌培养,分别提取基因组DNA,进 行常规PCR扩增。然后对multiPCR反应体系各种反应条件进行优化,成功 建立了m71h-*CR扩增方法。对H37Rv标准株和临床分离株分别采用常规P*R 和 nutiPCR同时进行扩增,结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段, 符合率达 100%。 二、单基因SSCP检测耐异烟朕基因突变 1.药敏试验:对SS株临床分离株进行培养并采用绝对浓度法中的间接法 进行药敏试验,培养基中异烟盼的浓度 10mg/L和 ling/L分别为高度和低度 耐药标准。在58株临床分离株中,药物敏感株23株,耐异烟姘分离株35 株,其中高度耐异烟朕27株,低度耐异烟姘8株。 2,单基因SSCP法检测结核杆菌耐异烟姘相关基因突变:分别扩增结核 分支杆菌 H打7Rv和 58株临床分离株的 phC启动子、inhA和 katG基因,并 将扩增产物进行 SSCP电泳分析,快速、特异地检出 phC启动子序列突变发 生率为17.1%旧心引、inhA序列突变发生率为川刀%门八引、ha旧序列突 变发生率为65,7%(士y3引。 3.直接测序法①irect Sequencing,DS)检测结核杆菌耐异烟胁相关基因 突变:将35株耐药临床株扩增产物切下进行胶口收、克隆、转化、提取质 粒。厂COR酶切、然后进行测序分析。在三个耐药基因中检出印hC启动子 序列突变发生率乃刀%门乃引、inhA序列突变发生率34.3%门工’3引、郎0 序列夹变发生率68.6o(2/35)。 4.两种方法结果比较:除inhA基因两种方法的结果有一定差异外,其 余两个基因SSCP与测序法的检出率十分相近。phC启动子
【学位授予单位】:中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R446.5

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 苏明权,于文彬,马越云,谭庆荣,范金水,丁振若;多重聚合酶链反应快速检测脑膜炎中的病原体[J];第四军医大学学报;2000年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 任忠和;王春梅;;结核病防控面临的形势及研究进展[J];包头医学院学报;2012年01期
2 鲁卫平;安琳;黎敏;;利用裂解型分支杆菌噬菌体快速检测结核分支杆菌[J];重庆医学;2008年03期
3 张永胜 ,李书琳 ,杨春福 ,张小刚 ,何秀云 ,赵福贵;结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究[J];中国医师杂志;2002年04期
4 王振军,史芸,王斌;结核分支杆菌耐药性检测方法研究进展[J];中国医师杂志;2005年S1期
5 顾晓明,吴卫东;新疆实施国家结核病防治规划效果评价[J];地方病通报;2005年04期
6 杨洪彩;黎唯;艾山江;;结核分枝杆菌消毒进展[J];地方病通报;2008年05期
7 程晓东,别良峰,苏明权,段艳,岳乔红,杨柳,张建芳,刘家云,郝晓柯,于文彬;结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的快速检测[J];第四军医大学学报;2003年23期
8 张武,李雄;肺结核的难治性与治疗对策[J];临床医学;1998年11期
9 彭春仙;姚京忠;卢伟力;张德和;祝进;徐礼锋;;结核分枝杆菌培养及耐药监测[J];临床医学;2006年04期
10 粱酉,张书平,张华,薛萍,张惠敏;成都地区部队中老年人群肺结核患病率调查[J];湖北预防医学杂志;2003年04期
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 谭景尹;PCR—膜芯片~(?)技术检测结核杆菌耐药基因突变的应用研究[D];广西医科大学;2011年
2 张影;溃疡性皮肤结核[D];广西医科大学;2011年
3 武洁;结核分枝杆菌及耐药结核分枝杆菌快速的检测研究[D];复旦大学;2011年
4 李文婧;耐多药肺结核病患者管理状况分析[D];山东大学;2011年
5 赵云龙;高敏C反应蛋白和血沉在脊柱结核治疗过程中变化规律的研究[D];宁夏医科大学;2011年
6 石学萍;血清新喋呤、腺苷脱氨酶及PPD试验对活动性肺结核诊断价值的研究[D];新疆医科大学;2011年
7 杜蓬;荧光微球技术在结核杆菌耐利福平菌株rpoB基因突变多重检测中的应用研究[D];西北大学;2002年
8 薛莹;结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因的克隆、表达、纯化及免疫学特性的初步研究[D];第四军医大学;2002年
9 吴桂辉;耐多药肺结核患者细胞因子网络调控和一氧化氮水平变化的研究[D];四川大学;2002年
10 王晓春;聚合酶链反应检测A组链球菌、白喉杆菌、嗜肺军团菌的实验研究[D];第三军医大学;2002年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 苏明权,马越云,谭庆荣,穆士杰,于文彬,丁振若;新型隐球菌聚合酶链反应的检测方法[J];第四军医大学学报;1997年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李锦宏;万海珍;刘铁牛;;结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究[J];中国实验诊断学;2010年11期
2 宋阳;于宏波;陈晶洁;韩忠波;;结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究[J];中国实验诊断学;2007年10期
3 何树梅;张敏;贺拥军;丁静;袁尔亚;;结核分枝杆菌异烟肼耐药与KatG基因相关性[J];中国公共卫生;2010年08期
4 梁建琴;吴雪琼;张俊仙;李洪敏;陆阳;;应用寡核苷酸探针膜杂交方法快速检测耐异烟肼结核分支杆菌基因型[J];河北医科大学学报;2006年04期
5 王海英,刘志敏,郑建礼,邓云峰;结核杆菌异烟肼表型耐药与katG基因突变相关性研究[J];齐鲁医学检验;2005年05期
6 宋阳;韩中波;于宏波;;结核分支杆菌利福平和异烟肼耐药基因的快速检测[J];中国实验诊断学;2006年11期
7 米润昭;结核分支杆菌引起的腮腺脓肿[J];国外医学.内科学分册;2002年11期
8 张宗德,马,贾红艳,古淑香,邢爱英,韦攀健;结核分支杆菌katG基因第463位密码子突变与异烟肼耐药的研究[J];中华结核和呼吸杂志;1999年03期
9 吴为群,吴忠道,张扣兴,谢灿茂,容中生;结核分支杆菌异烟肼耐药的分子机制及其快速鉴定[J];热带医学杂志;2003年03期
10 乐军,李瑶,谢建平,徐永忠,梁莉,王洪海;寡核苷酸表达谱揭示异烟肼耐药对结核分支杆菌致病性的影响[J];中华医院感染学杂志;2004年12期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张文宏;陈澍;庞茂银;翁心华;;结核分支杆菌katG基因突变与其耐异烟肼机制的研究[A];中华医学会第七次全国感染病学术会议论文汇编[C];2001年
2 乐军;刘丽蓉;谢建平;王洪海;;异烟肼耐药和敏感结核分支杆菌的比较蛋白质组学研究[A];中国防痨杂志2003第25卷增刊——2003年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2003年
3 陈曦;马玙;金奇;李传友;姜广路;王庆;;耐异烟肼结核分支杆菌耐药相关基因突变研究[A];中国防痨杂志2003第25卷增刊——2003年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2003年
4 张永胜;李书琳;李昕;张小刚;何秀云;;结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究[A];中国防痨协会全国学术会议大会学术报告[C];2001年
5 程晓东;别良峰;苏明权;张荣;岳乔红;于文彬;郝晓柯;;快速检测耐异烟肼结核分支杆菌方法的研究[A];第十届全军检验医学学术会议论文汇编[C];2005年
6 裴秀英;郝方;;结核分支杆菌异柠檬酸酶的克隆表达及蛋白组学研究[A];中国蛋白质组学第二届学术大会论文摘要论文集[C];2004年
7 陈子芳;劳海黎;李永德;;痰多管接种培养结核分支杆菌阳性率的实验观察[A];结核与肺部疾病论文集[C];2006年
8 糜祖煌;秦玲;;结核分支杆菌三种不同靶基因传统PCR巢式PCR检测比较研究(摘要)[A];中华医学会第六届全国结核病学术大会论文汇编[C];2000年
9 武建强;;聚合酶链反应检测结核分支杆菌在临床诊断中的意义分析(摘要)[A];中华医学会第六届全国结核病学术大会论文汇编[C];2000年
10 丁淑琴;王强;王淑静;王洁;张焱;;结核分支杆菌rps12基因的克隆及生物信息学初步分析[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;抗结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌药(一)[N];农村医药报(汉);2007年
2 伊拉;抗结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌药(三)[N];农村医药报(汉);2007年
3 黄芳;服用抗结核药的饮食宜忌[N];中国中医药报;2008年
4 解放军302医院中西医结合肝病科主任 刘士敬;肝不好四类药别吃[N];健康时报;2009年
5 尤志军;一气错服药 一怒要杀人[N];医药经济报;2002年
6 ;将抗痨进行到底[N];医药经济报;2005年
7 中南大学湘雅医院营养科教授 李惠明;结核病人的营养法则[N];大众卫生报;2006年
8 赵永春;结核病人饮食有禁忌[N];中国中医药报;2007年
9 吴承杰;警惕异烟肼致乳腺增生[N];农村医药报(汉);2009年
10 张旻炜 刘文芳 陈小云;异烟肼治疗菌痢[N];农村医药报(汉);2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘振威;健康成人原代肝细胞体外实验测定异烟肼和利福平的肝代谢和肝毒性的研究[D];复旦大学;2004年
2 张红梅;结核分支杆菌特异的PE/PPE蛋白应用于结核病血清学诊断的初步研究[D];复旦大学;2006年
3 莫凌;异烟肼耐药相关基因及其功能分析[D];复旦大学;2003年
4 廖艳;异烟肼与利福平肝毒性的代谢组学研究[D];四川大学;2005年
5 乐军;耐药结核分枝杆菌的多维分析[D];复旦大学;2003年
6 黄海荣;结核分支杆菌利福平敏感性分析的研究[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2001年
7 张志华;异烟肼和利福平合用致肝细胞毒性及药物保护机制探讨[D];河北医科大学;2009年
8 蒋正静;过渡金属的氮杂环配合物、稀土金属离子诱导的簇合物的合成及结构研究[D];南京理工大学;2009年
9 李万里;异烟肼缓释微球治疗家兔膝关节滑膜结核的实验研究[D];四川大学;2006年
10 乐江;CYP2E1介导异烟肼肝毒作用机制及其有效干预措施研究[D];武汉大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 程晓东;multi-PCR-SSCP检测耐异烟肼结核分支杆菌方法建立和初步临床应用[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
2 覃岭;异烟肼在氧应激状态下对人肝细胞体外毒性作用的研究[D];重庆医科大学;2011年
3 孟令俊;结核病合并肝功能损害患者的异烟肼血药浓度检测研究[D];天津医科大学;2011年
4 许强华;结核分支杆菌TB32Ag、MPT64Ag的基因克隆及初步表达[D];西北大学;2001年
5 段自皞;利福平和异烟肼的肝脏毒性作用及部分机理[D];安徽医科大学;2010年
6 孙超群;逆向点杂交方法检测结核分支杆菌耐药基因katG、rpoB突变[D];第二军医大学;2005年
7 郭丁妮;异烟肼和利福平合用致小鼠肝细胞毒性及肝药酶选择性抑制剂对其保护作用的机制探讨[D];河北医科大学;2010年
8 张玉坤;超顺磁性异烟肼PELA微球体内外释放及其安全性评价的初步研究[D];重庆医科大学;2011年
9 吴静希;结核分支杆菌PE/PPE特异性基因的克隆表达及初步应用[D];西北农林科技大学;2011年
10 杨柳;结核分枝杆菌多重耐药基因快速检测方法学的研究[D];第四军医大学;2004年
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