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《中国人民解放军第四军医大学》 2003年
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VEGF基因转染的骨髓基质细胞复合磷酸钙陶瓷成骨能力研究

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【摘要】: 组织工程是应用细胞生物学和工程学原理,对病损组织结构和功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴学科。其目的是研究和开发组织替代物。本研究对用组织工程方法再造骨组织进行了一系列的研究。 1.骨髓基质细胞成骨能力的实验研究 方法:体外分离、培养MSCs,观察其生长特点并进行碱性磷酸酶(ALP)组织化学染色;用矿化液连续培养,观察其骨形成能力。结果:倒置显微镜下观察,在矿化条件下,细胞传代培养5—6天后,长至铺满,细胞连续培养30天,Von-Kassa染色显示有局灶状钙盐沉积。结论:MSCs易于分离培养,体外扩增速度快,在矿化条件下,骨髓基质细胞在体外即具有很强的成骨能力,可以形成矿化结节。因而可以作为种子细胞,用于骨组织工程。 2.人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建及鉴定 方法:利用基因克隆技术,将位于原核克隆载体pSP73上的目的基因VEGF_(165)克隆到真核表达载体pcDNA3.1上。将获得的真核表达质粒pcDNA3.1进一步用限制性内切酶酶切鉴定及基因测序,证明人VEGF_(165)基因正确克隆到pcDNA3.1真核表达载体上。 3.人血管内皮生长因子165基因转染骨髓基质细胞 方法:利用基因转移技术,将构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF_(165)通过脂质体介导转染SD大鼠骨髓基质细胞,然后以G418筛选阳性克隆,用免疫细胞化学方法鉴定。免疫细胞化学证实,重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF_(165)基因的表达。 4.骨髓基质细胞诱导培养后与磷酸钙陶瓷复合的实验研究 方法:分离的骨髓基质细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养,经矿化液诱导培养后分化为成骨细胞。将该细胞与预备处理后的磷酸钙陶瓷复合,通过细胞计数检测附着后的细胞生长增殖特性,并在扫描电镜下观察细胞 第四军医大学硕士学位论文 在磷酸钙陶瓷表面的贴附情况。结论:磷酸钙陶瓷的生物相容性良好,细 胞贴附后继续保持成骨细胞的表型,可以作为骨组织工程的支架材料。 5.基因转染的自体细胞与磷酸钙陶瓷复合异位成骨的研究 方法:成年雄性 SD大鼠 12只,全麻及无菌条件下取其左侧股骨、胜 骨。将骨髓细胞接种入培养瓶中体外扩增培养,第sd开始用矿化液诱导培 养持续1周,骨髓基质细胞向成骨细胞分化,诱导后的细胞行传代培养。l 周后将骨髓基质细胞消化并在脂质体介导下进行VEGF;6s转染及G-418连续 筛选 14d。然后将转染的和末转染的自体细胞混合一同接种于磷酸钙陶瓷上 体外继续培养7d。最后将细胞一陶瓷复合体植入大鼠背部皮下和肌肉内。结 论:应用以磷酸钙陶瓷为支架的VEGF165基因转染自体骨髓基质细胞种植, 在组织工程骨周围有较多的血管形成,异位骨形成能力较好。
【学位授予单位】:中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R318.08

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