Notch-Deltal对人牙髓干细胞增殖及分化影响的实验研究

【摘要】：牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells DPSCs)的概念是由Shi S和Gronthos S于2000年提出来的。认为它们是存在于牙髓组织中具有干细胞性质的未分化间充质细胞，具有多向分化潜能，可形成功能性的成牙本质细胞和牙本质。DPSCs相继在成年牙髓及乳牙残髓中被发现。这个概念的提出，是对从前所谓牙髓“前体细胞”性质的进一步认识，为成体干细胞的研究增添了新的内容，并使牙齿组织工程有了突破性进展。2000年7月，一项由NIH资助的利用DPSCs组织工程化牙齿的技术获得成功，并取得专利。 但是，同其它组织干细胞一样，DPSCs体外培养也会逐渐失去自我更新能力，发生老化。同时由于缺乏特异性标志，目前还无法实现DPSCs的体外纯化，所以DPSCs作为组织工程种子细胞难以大量扩增培养的问题尤为突出。对干细胞进行基因改造，保持其在体外的自我更新能力，是解决的思路之一。 在细胞增殖和分化研究领域，Notch信号途径近年来备受关注。作为一种进化保守性细胞间相互作用机制，Notch信号途径对多种细胞的增殖、分化和凋亡过程都有影响。该信号途径最根本，也是最重要的作用体现在：其介导的侧抑制作用(Lateral 第四军医大学博士学位论文 inhibition)可使细胞谱系特异性基因表达受阻，从而使细胞保持未 分化状态。最近有人提出利用Notch信号的这种“分化抑制作用”， 对干细胞的增殖和分化进行调控的设想，并在造血干细胞研究方 面取得了一些令人鼓舞的结果。例如:研究人员将活化形式Notch 受体导入造血千细胞，使其获得了细胞因子依赖性的“永生”;另 外，Notch的配体Delta、Jagged具有类有丝分裂因子作用，可 保持造血干细胞的自我更新能力，促进其体外增殖。 目前，Notch信号对DPSCs是否也有类似作用尚不明确。既 往研究显示:早在牙齿发育期，Notchl就表达于颈环星网状层的 干细胞中，是其保持干细胞性质的重要机制;Notch一Delta信号还 与成釉细胞、成牙本质细胞分化有关，被认为是牙齿发育细胞分 化多样性的原因之一;另外，目前己明确与牙胚细胞分化有关的 生长因子如TGF日、FGF、BMPs等均可诱导Noteh受、配体的 表达。因此，有学者推测Notch信号在DPSCs自我更新和分化过 程中很可能扮演重要角色，通过它对DPSCs进行调控具有很大的 可行性，但目前尚缺乏足够的实验证据。本研究拟在分离鉴定人 牙髓干细胞的基础上，采用逆转录病毒基因转导技术，将Notch 配体一Deltal基因导入该细胞，探讨Deltal对DPSCs增殖、分化 的影响，并对此基因转导细胞作为组织工程种子细胞的可行性进 行初步探索，主要实验方法和结果如下: 1.人牙髓干细胞的体外分离、培养和鉴定: 参照并改进文献报道的方法，从成人健康阻生齿中取得牙髓， 采用酶消化法分离获得牙髓干细胞，进行原代培养及传代培养。 从以下三个方面对牙髓干细胞进行鉴定: ①细胞克隆形成能力:DPses eFu一F计数为2一1 sclones八03 cell; ②细胞的免疫表型:免疫组化及RT一PCR结果显示细胞 vimentin(干细胞标志之一)、I型胶原(牙本质基质主要成分)、 GFAP和nestin(神经峭来源标志)、ALK和osteoealein(钙化组 第四军医大学博士学位论文 织标志)表达阳性;而无或极少MyoD(肌细胞标志)、P队RY(脂 肪细胞标志)和DSPP(成牙本质细胞标志)的表达; ③细胞的多向分化能力: 成脂诱导一以100卜g/ml叫噪美辛+10协g/ml胰岛素+0 .smM IBMx+l林M Dex诱导3w，细胞出现脂肪细胞标志蛋白ppAR丫、 LPL的表达;sw细胞内有油红O染色阳性脂滴形成; 成肌诱导一经1印MS-氮杂胞营诱导，分别在24一48h、15d 左右和21d出现肌细胞标志蛋白MyoD、desmin及myosin的表达， 约18d左右可见有粗大的肌管样细胞形成。 成牙本质诱导一nPses在IMnM+loo，OFBs+lommolzLp一甘 油磷酸钠+50林g/ml vitC+l onmol/L Dex诱导液中连续培养，部分 细胞可出现复层生长，形成细胞结节并钙化，25d左右结节区钙 质染色阳性，细胞有成牙本质细胞标志蛋白DSPP表达。 上述结果提示，本实验分离培养的细胞在体外具有一定的克 隆形成能力，其表面分子的表达情况与文献报道相似，一定条件 下部分细胞可被诱导向脂肪、肌细胞和成牙本质细胞方向分化， 具有可塑性，符合干细胞的特征。 2.oe!t。1一〔G「P双顺反子逆转录病毒表达载体的构建、体外 包装和重组病毒液的制备: 采用基因重组技术构建Deltal一EGFP双顺反子逆转录病毒表 达载体pDeltal一IRES一EGFP，EGFP作为Deltal表达的报道基因; 电穿孔法将重组载体分别转入单、双嗜性包装细胞GP+E86和 队317，经嘿吟霉素(puromyein)筛选，得到阳性表达克隆;各选 取其中滴度最高的病毒生产细胞，“乒乓球”法提高重组病毒滴度 至9.7 x 105cFu/ml;重组病毒感染NIH3T3细胞，倒置荧光显微 镜可观察到细胞胞浆内明亮的绿色荧光，RT一PCR结果显示细胞 Deltal mRNA表达显著升高。 Dehal一IRES一EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的成功构建 第四军医大学博士学位论文 和高滴度重组病毒液的获得，为下一步对DPSCs进行基因改造打 下良好的基础。 3.De!tal对牙髓干

【关键词】：牙髓干细胞 细胞分化 增殖 信号转导 Notch Delta 逆转录病毒 基因转染 组织工程
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R780.2
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