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《第四军医大学》 2004年
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天然抗角蛋白自身抗体转基因小鼠的建立及相关研究

李巍  
【摘要】:自从Krogh等1970年发现抗角蛋白自身抗体(anti-keratin autoantibody,AK auto Ab)以来,众多学者对其天然存在、生物学特性、生理及病理意义等方面进行了较为广泛的探索。目前研究提示AK auto Ab可能参与了皮肤的多种生理和病理过程,并具有重要的调节作用。然而,由于实验方法等方面的局限性,以往对于AK auto Ab生理、病理意义的认识仍较为有限,而且以往常规的方法无法进行AK auto Ab产生机制等关键问题的研究。因此,为了全面研究AK auto Ab的特性并探讨其产生机制,建立一种理想的模式生物进行在体研究就显得非常必要。 近年来抗体转基因动物技术的成熟和应用为彻底阐明上述问题提供了可能。按照抗体基因表达的等位基因排斥定律,如果将经过重排的抗体基因导入转基因小鼠的基因组,那么这些基因将会先于内源抗体基因表达,而且内源抗体基因将不再发生重排,该转基因小鼠将主要表达同一抗原特异性的B细胞。这样就可能得到高表达某一种抗体的动物模型来分析该抗体的生物学作用,也可以获得足够数量的同一 第四军医大学博士学位论文 抗原特异性的B细胞以分析其选择/耐受机理。 本课题组以往的研究进展己经为转基因小鼠的建立奠定了良好的 基础:我们应用未免疫小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合,成功筛选到了 4株分泌抗角蛋白IgM抗体的杂交瘤,并发现单克隆抗角蛋白抗体的 亲和力差异很大。这些更具天然性的未免疫小鼠杂交瘤抗体的获得不 仅有助于我们进一步探讨AK auto Ab的特性和生物学作用,更为深入 研究AK auto Ab的产生机制等长久以来困扰我们的难题提供了非常好 的实验材料。 本研究首先从小鼠表皮提取了小鼠角蛋白,然后应用NH4SCN洗 脱法比较了天然抗角蛋白杂交瘤抗体的相对亲和力,选择高亲和力的 抗角蛋白抗体用以构建转基因小鼠,并初步进行了表型分析。 一、转基因载体构建及表达 采用RT-PCR方法克隆分泌AK auto Ab的杂交瘤3B4的重链和轻 链可变区基因,连接抗体转录启动子、增强子及恒定区基因序列,构 建成重链转基因质粒pIC林一VZH:和轻链转基因质粒pBsck一Zvk4。电穿 孔法进行了体外真核细胞转染,ELISA、RJ’- PCR、流式细胞仪方法验 证转基因载体可以表达抗体3B4基因。 二、抗体重链转基因小鼠建立及基因型分析 将线性化的质粒显微注射入CBA X C57BL/6小鼠的受精卵细胞的 雄前核内,然后导入假孕雌鼠的输卵管。共注射约200枚卵,娩出小 鼠80只。提取小鼠尾巴基因组DNA进行PCR分析,共获得12只转 基因阳性小鼠。Southem blot分析进一步证实转基因存在。 三、抗体重链转基因小鼠表型分析 以anti一19入刀anti一190抗体、anti一IgN灯anti一IgMa/anti一IgMb抗体分析转 基因小鼠B细胞等位基因排斥情况,发现50%一80%的B细胞表达转 基因编码的IgM;EuSA分析转基因小鼠外周血中抗角蛋白IgM和总 第四军医大学博士学位论文 [gM水平,发现部分转基因小鼠的抗角蛋白IgM水平明显高于对照小 鼠,而总IgM水平没有差异。 以anti一B220/anti一IgM抗体分析了转基因小鼠中枢和外周B细胞数 的变化及成熟情况,发现骨髓、脾和腹腔的成熟B细胞数都明显下降, 其中骨髓和腹腔约为对照野生鼠的一半,而脾更低至三分之一。 Anti一19树anti一CDS抗体进一步分析B细胞亚群的情况,结果骨髓和脾 的CDS十B细胞/C DS一B细胞比例与对照没有差异,而腹腔的CDS十B细 胞明显增多。从而提示,腹腔里增加的CDS+B细胞可能导致了血清里 抗角蛋白IgM水平的提高。 四、AKaut0Ab产生的细胞基础研究 应用ELISPOT方法和EL工SA方法对体外培养的转基因小鼠和野生 小鼠的脾和腹腔细胞中分泌AK autOAb的细胞数量及分泌AK autoAb 的水平进行了分析。结果发现野生小鼠脾细胞中分泌AK autoAb的细 胞数远远少于腹腔细胞,其分泌的抗体滴度也显著低于腹腔细胞;在 转基因小鼠获得了相同的结果,其腹腔中分泌AK autoAb的B细胞数 又远远多于野生小鼠。 结合anti一CDS抗体的分析结果,我们有足够的信心得出这样的结 论:腹腔B细胞是AK auto Ab的主要来源,转基因小鼠腹腔内增高的 CDS毛细胞是产生AK autoAb的主要细胞。 本研究成功建立了AK auto Ab的转基因小鼠模型,为进一步在体 研究AK auto Ab的功能作用奠定了良好的基础;并利用转基因小鼠初 步分析了AK auto Ab的产生机理,明确了AK auto Ab产生的细胞基础。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R392

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