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《第四军医大学》 2004年
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正常人骨髓成纤维样基质细胞系对急性髓细胞性白血病细胞增殖、分化和凋亡的影响

梁蓉  
【摘要】:白血病是造血细胞恶性克隆性增殖所致,是常见的恶性肿瘤之一,虽然20年来在白血病发病机理的研究和诊断治疗上取得很大的进展,但是还有很多如难治和复发性白血病、造血干细胞移植后复发等等诸多难题需要解决。既往对白血病的研究多集中在白血病细胞本身,对造血微环境在白血病的发生发展中扮演什么角色研究甚少。而白血病细胞象正常造血细胞一样,依赖造血微环境存活。骨髓基质细胞是造血微环境的主要成分,通过分泌细胞因子和/或直接黏附,对正常造血具有调控作用。近年来国内外研究越来越发现它在白血病细胞恶性克隆的选择、增殖、分化、迁移和凋亡中起重要作用。通过对骨髓基质细胞和白血病细胞相互作用的研究,不仅可以使我们更深入地了解白血病的发病机制,而且可以对白血病发展过程中出现的骨髓造血抑制、白血病细胞的耐药、白血病的复发等病理现象的机制产生新的认识,为白血病治疗提出新的思路和策略。 从目前的研究结果来看,最初多采用人体外长期培养的骨髓基质细胞——一种混合的细胞体系,来研究其与白血病的关系。现在随着各种正常人骨髓基质细胞系的出现不仅为体外实验带来方便,同时也利于我们搞清楚到底是那一种基质细胞在起作用。由于大约20%急性B淋巴细胞白血病传统化疗无效,缓解后易复发,而且B淋巴细胞前体的增殖与骨髓基质细胞密切相关,所以对急慢性B型淋巴细胞白血病的研究较多, 第四军医大学博士学位论文 目前研究发现骨髓基质细胞能抑制其对化疗药物所致的凋亡,其机理可能 是通过VLA一4,5及其配体VCAM一1和ICAML一l起作用:最新研究又发 现还伴有bcl一2表达增高和caspase3活性的减低。但迄今为止,骨髓基质 细胞到底是通过什么具体的分子机制抑制白血病细胞对化疗的凋亡易感 性还不明确。对于急性髓细胞性白血病(Aeute Myeloid Leukemia,AML) 的研究目前发现,体外长期培养的正常骨髓基质细胞对AML细胞有促增 殖和向成熟粒细胞和单核细胞分化的作用;而另一研究却发现骨髓成纤维 样基质细胞在没有化疗药物时,能抑制AML细胞的集落形成,但在化疗 药物存在下,反而能促进白血病细胞的集落形成:又有研究表明,与骨髓 成纤维样基质细胞系直接接触,能抑制化疗药物引起的AML细胞的凋亡, 而且与bel一2表达强弱无关;最新文献报道一种小鼠基质细胞系能阻止 AML细胞系HL一60和病人AML细胞的化疗所致的凋亡,伴有Bcl一2家族 (bcl一2、bel一xL)的表达增高,而且可能与基质细胞分泌因子有关,这一 结果与上一个报道相左。到目前为止,均表明骨髓基质细胞对AML细胞的 存活有影响,但究竟是哪一种基质细胞起主要作用,对AML细胞凋亡易感 性和药物敏感性的影响是否像急性淋巴细胞白血病一样,是否也有凋亡相 关分子以及其他信号传导分子的参与,到底是通过直接接触还是分泌某种 因子作用大,以及相互作用后白血病细胞基因表达谱存在什么样突出改 变,目前还都不明确,故AML细胞与基质细胞相互作用及分子机理有待进 一步研究。 本实验以AML细胞系为研究对象,观察正常人骨髓成纤维样细胞系 HFCL对急性单核细胞白血病细胞系U937、急性粒细胞白血病敏感细胞 HL一60和多药耐药细胞HL一60邝CR增殖和分化的影响:观察HFCL细胞 对HL一60细胞和HL一60丹CR凋亡易感性的影响;检测HFCL细胞对HL一60 细胞基因表达谱的影响,进一步探讨HFCL细胞对HL一60细胞增殖、分 化和凋亡影响的分子机理。本实验建立了U937、HL一60和HL一60那CR细 胞与HFCL细胞的共培养模型,实验分三组分别为:①对照组:单独培 养U937、HL一60和HL一60丹CR细胞:②直接接触组:先种HFCL细胞 一3一 第四军医大学博士学位论文 48h后,再在已贴壁的HFCL细胞上直接加入悬浮生长的U937、HL一60 和HL一60邝CR细胞。③transwell组:先种HFCL细胞48h后,按millipore transweu的说明,放入transwell(孔径0.4卜m)装置,以保证培养液和可 溶性因子能上下相通,而装置内外的细胞被隔开,在transwell中加入 U937、HL一60和HL一60戊CR细胞。采用台盼蓝拒染法测定生长曲线;硝 基四氮哇蓝(NBT)确定细胞分化;流式细胞仪检测细胞周期和CDllb、 CD13、CD14、CD33细胞表面抗原进一步鉴定细胞分化:W七stem blot检 测增殖细胞核抗原(proliferating Cell Nuelear Antigen,pCNA)和p糖蛋白 (P一GlycoProtein,Pgp)的表达。采用瑞氏一吉姆萨染色在光镜下和叮咙橙/ 澳化乙陡(AO/EB)染色在荧光显微镜下进行形态学观察,TUNEL检测 晚期凋亡细胞,流式细胞仪检测细胞周期、凋亡峰和AnnexinV阳性的早 期凋亡细胞。Westem blot检测Bel一2、活化的Caspase一3蛋白和P糖蛋白 (PgP)的表达变化。本实验采用Affymetrix公司的人类全基因组u133A 寡核昔酸微阵列基因芯片,来检测HL一60细胞与HFCL细胞共培养前后 基因表达谱的改变,并采用半定量RT-PCR、Northem blot、W七stem blot 和EUSA Kits进一步验证芯片结果。 本研究主要发现如下: 1.在正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL对AML细胞系增殖和分化 影响的研究中发现,与HFCL细胞共培养96h后,U937、HL一60和 HL一60瓜CR细胞的生长受抑,且与HFC
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