抗菌/抗内毒素多肽葛佬素的表达、纯化及其生物活性的初步研究

【摘要】：牙髓炎是口腔最常见的疾病之一，研究表明感染性牙髓炎主要的致病菌是G~-菌，而内毒素(lipopolysaccharide,LPS)是主要的毒力因子。实验研究发现，LPS能诱导单核-巨噬细胞、成纤维细胞等细胞分泌多种炎症细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8等，产生炎症级联反应，导致血管通透性增加、牙髓腔内渗液增多、髓腔压力增大，从而引起牙髓炎症状。因此研究拮抗LPS的治疗措施，降低LPS对牙髓细胞的毒性作用，对牙髓炎的防治和活髓的保存具有重要意义。 葛佬素(Gloverin)是一种存在于蚕蛹中的抗菌肽，分子量为13.8KD。该蛋白可结合LPS，阻断LPS的生物学效应，是一种具有杀灭G~-菌、中和LPS双重作用的抗菌肽。虽然本实验室前期将葛佬素在非洲绿猴肾细胞株COS-7中进行了表达，同时证明该表达产物具有杀灭大肠杆菌J5的作用，但是由于葛佬素在COS-7细胞中表达量还很低，远不能满足科研及临床应用的需要，因此利用原核表达系统表达具有生物活性的重组葛佬素多肽，成为获得大量葛佬素以及进一步研究其生物学效应的一种选择。 本研究目的即在采用基因工程技术对葛佬素蛋白进行重组表 第四军医大学博十学位论文 达，观察该蛋白体外中和LPS的活性以及对原代牙髓细胞炎性细 胞因子IL一1日释放的影响，为葛佬素的进一步应用研究奠定理论 基础。 本研究首先采用PlvEx2.3载体构建葛佬素原核表达质粒 PlvEx2.3一G，表达产物c末端带有聚组氨酸的标签。该标签对表 达的蛋白活性和结构影响很小，但为表达蛋白的鉴定和纯化带来 了极大的方便。然后应用快速翻译系统500(Rapid Translation system 500，RTS500)对目的蛋白进行快速表达和初步鉴定。RTS 系统是一种非细胞翻译系统，是以无活性的大肠杆菌裂解产物为 底物进行蛋白的体外合成，可以克服细胞表达体系中不可溶(形 成包涵体)、细胞毒性或容易被降解等主要问题。PlvEX2.3一G通 过RTSSOO表达后产物SDS一队GE电泳结果显示表达产物分子量 约为14KD;蛋白免疫印迹结果显示该蛋白带有聚组氨酸标签; 采用生物传感器对表达蛋白进行生物活性初步分析结果显示表达 产物与类脂A(I iPidA)有一定的亲和性。 由于RTS500系统试剂盒较昂贵，且只能作有限次表达反应， 表达量无法完全满足生物活性研究的需要。因此在以上工作基础 上，我们应用活的大肠杆菌BL21(DE3)对目的蛋白进行表达及纯 化，以期获得大量的目的蛋白。 重组质粒plvEx2.3一。转化BL21(DE3)并经IPTo诱导后，收 集细菌并对细菌进行超声破碎，SDS一队GE电泳结果显示分子量 为14KD的表达产物主要存在于超声碎菌后的菌液上清中;蛋白 免疫印迹结果显示该蛋白带有聚组氨酸标签;应用NiZ气NTA鳌 合物树脂对表达产物进行纯化，结果显示纯化后的蛋白纯度达到 95%以上。采用宣试剂对表达产物的生物学活性研究结果表明该 表达产物对LPS具有明显中和活性，并呈明显的剂量效应关系。 以上生物化学、免疫学尤其是生物活性分析，表明该表达产物即 第四军医大学博士学位论文 为重组葛佬素。 在体外培养的原代牙髓细胞模型中，重组葛佬素蛋白能够抑 制LPS刺激后牙髓细胞炎性细胞因子IL一lp的释放。 综上所述，本研究应用基因工程方法成功构建了抗菌肤葛佬 素原核表达载体，并进行了体外快速表达和原核表达;最终获得 的重组葛佬素蛋白能够中和LPS，能够抑制LPS诱导的原代牙髓 细胞炎症细胞因子比一lp的释放，为牙髓炎中活髓保存提供了新 的思路。