NT-3转染雪旺细胞在外周神经损伤修复中的作用

【摘要】：周围神经缺损后的再生和功能恢复一直是神经科学领域的热门问题。由于周围神经结构和功能上的特殊性，大多数情况无法直接对拉吻合，因此必须寻找一种神经替代物来修复缺损。近十年来，随着材料科学和分子生物学的发展，用于神经修复研究的材料品种越来越多。对于神经修复的研究重点也已从单纯地对神经修复技术的研究转向为对神经再生的研究。 神经营养素-3(neurotrophi n-3, NT-3)是由774个氨基酸组成的、与神经结构和功能密切相关的家族蛋白，调控着神经元的发育、生长、分化和生存，对维持神经系统的正常功能承担着重要作用。研究发现，NT-3是维持外周雪旺细胞和神经元生存的重要物资。 本论文采用RT-PCR的方法，从人肝脏组织中克隆NT-3 cDNA基因，构建携带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)标签的真核表达载体pIRES2-EGFP-NT-3，并采用阳离子脂质体介导的方法，将其转染雪旺细胞，观察转染细胞NT-3表达和分布情况，建立稳定表达NT-3的雪旺细胞：将SC-NT-3与DRG神经元细胞体外共培养，观察神经元细胞的生长及轴突再生情况；应用组织工程的方法构建人工神经，联合应用转染NT-3的雪旺细胞修复周围神经缺损。建立了一种构建人工神经的方法，希望能为周围神经缺损的修复提供一种可行的选择。实验分为以下六个部分： 1．雪旺细胞的体外培养：目的在于改进雪旺细胞的体外培养条件，以获得足够数量的较纯净的雪旺细胞应用于神经修复。使用5-7d的SD仔鼠坐骨神经，采用混合酶多次消化法分离雪旺细胞，阿 第四军医大学博士学位论文 糖胞昔、G一418抑制成纤维细胞生长，氟丝扣林促进雪旺细胞分裂增 殖，低浓度胰酶快速消化传代进一步纯化雪旺细胞。结果发现使用 上述方法可以获得大量的高纯度雪旺细胞，经抗S一100蛋白单抗通 过SABC法染色鉴定，雪旺细胞纯度可达到97%以上。 2.NT一3--cDNA基因的克隆及重组真核表达载体的构建:针对人 的NT一3一cDNA序列，设计了包含起始密码子和终止密码子的一对引 物，分别在其5’端加上Eo0RI及 BamH工酶切位点，经RT一PCR扩 增的774bp的特异性片段插入到pUC19载体后筛选出 pUC19一NT一3一cDNA阳性克隆，经序列测定，证实与序列号“NT--3 002527”的同源性为100%。将测序正确质粒pUC19一NT一3进行经EeoR 工/B amH工双酶切，切下的NT一3片段定向克隆到真核表达载体 p工RESZ一EGFP，随机挑选数个菌落，提取质粒，经EcoRI/B amH工双 酶切及PCR鉴定，成功构建重组质粒p工RESZ一EGFP一NT一。 3.稳定表达NT一3的雪旺细胞的建立:将携带绿色荧光蛋白的重 组真核质粒p工RESZ一EGFP一NT一3转染雪旺细胞，观察转染后雪旺细胞 生物学行为。发现外源NT一3明显使雪旺细胞的有丝分裂增快，细胞 增殖增快，并建立了体外稳定表达NT书的雪旺细胞。 4.稳定表达NT一3的雪旺细胞与背根神经节(DRG)神经元细胞的共 培养实验:我们建立了能够稳定表达、分泌NT一3蛋白的雪旺细胞， 通过与DRG神经元细胞的共培养实验，了解神经元细胞的生长情况。 实验发现，与对照组相比，SC一NT一3共培养组神经元的数量以及突起 的长度均显著高于对照组，由此可以看出，外源性NT一可减轻DRG 神经元细胞的退行性改变。 5.人工周围神经的构建:目的是通过对雪旺细胞三维培养，获 得细胞一生物材料复合的理想方法以构建人工周围神经。方法是将 牛去细胞基质(BAM)、BrdU标记的 SC一NT一3·血李专口培养基按一定 的比例混合，注入PLGA神经导管，370C、5%C02孵育30分钟形成 凝胶。培养1d后植入SD大鼠臀大肌中，观察SC一NT一3在体内的生 第四军医大学博士学位论文 长情况。3周后导管内充满大量雪旺细胞，经BrdU抗体染色观察， 植入的雪旺细胞仍然存活。本实验中使用雪旺细胞的三维培养体系 是构建人工周围神经较为的理想方法。 6.周围神经缺损的修复:用上述方法构建的人工周围神经来桥 接SD大鼠坐骨神经10Inlll缺损。实验组:A组为PLGA导管+转染NT书 的雪旺细胞;B组为PLGA导管+未转染NT一3的雪旺细胞。对照组: C组为自体神经移植。四个月后通过免疫组化、电生理、透射电镜、 H即逆行示踪等方法检测神经再生及坐骨神经功能恢复情况。发现各 组坐骨神经均得到再生，修复效果A组最佳，B组与C组无显著性差 异。表明复合NT召的人工周围神经对周围神经缺损的修复有较好的 疗效。 通过以上研究得出以下结论: 1.体外培养的雪旺细胞可以通过Ara一c、G一418及控制消化时间 等步骤在较短时l’9J得到纯化并大量增殖。 2.外源性神经营养因子NT一3能明显促进雪旺细胞的有丝分裂和 增殖。 3.利用组织工程原理与方法利用雪旺细胞、B胡、PLGA在体外构 建组织工程周围神经，可以解决目前神经组织工程的难点。 4.利用体外构建的人工周围神经修复SD大鼠10Inln坐骨神经缺 损，修复效果较好，转染NT书组的修复效果超过了自体神经移植组， 表明该人工神经构建合理，对神经再生有良好的促进作用，为临床 应用提供的有益的尝试。

【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R651.3