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以人骨髓间质干细胞构建工程化软骨的实验研究

庞永刚  
【摘要】:头颈部软骨组织的缺损,传统方法是以自体、异体组织或人工材料作为供体进行修复,但其存在着供体来源有限、供体与受体形状匹配困难、异物反应及易感染等不足。而以生物学及工程学方法合成具有功能的损伤组织替代物的组织工程技术有望解决上述难题。种子细胞及其来源问题是目前组织工程在生物方面面临的最大挑战。骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是存在于骨髓基质内的非造血系细胞来源的亚群,具有较强的扩增能力,在一定的条件下可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞及神经细胞等分化,有望成为组织工程的较理想的种子细胞。 鉴于人骨髓间质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)向软骨细胞分化的强大潜能,hMSCs可为软骨组织工程种子细胞的来源开辟新的途径。本课题即从hMSCs作为种子细胞构建工程化软骨的角度出发,探讨其体外培养过程的影响因素,建立一种优化的培养方法,以获得纯度高、扩增能力强的hMSCs,并能够在扩增过程中保持其良好的分化潜能。通过对hMSCs体外诱导 第四军医大学博士学位论文 分化的研究,进一步探讨其作为组织工程种子细胞的可行性。从引 产胎儿获得加SCs并进行体外培养,研究从引产胎儿获得的加SCs 的生物学特性,探讨获得hMSCs的新途径。采用深低温保存技术冻 存刊MSCs,并在一定的条件下复苏培养,研究复苏后hMSCs的扩增 能力、分化潜能,探讨建立hMSCs库的条件。将扩增后的hMSCs 在PGA支架上进行立体成软骨诱导培养,并在裸鼠体内构建工程化 软骨,探讨以hMSCs构建工程化软骨的方法。从定t角度出发,研 究从骨翻获得到构建成工程化软骨这一过程中的有关定t关系,为 临床应用提供实验依据. 材料和方法 1人骨位间质干细胞的获取及优化培养 研究分离方法(包括密度梯度离心法、全骨任法),接种密度(1 xl04、l火105、2.5xl05、5xl05、lxl06及2.5x106/cmZ)、首次换 液时间(第1、2、3、……10天进行首次换液)、培养基(D州[EM 和a.州王M)、血清种类和浓度(10%、巧%、20%)几个影响因素 对hMSCs生长的影响。比较细胞出现伸展的时间、原代培养时间和 细胞生长曲线.以流式细胞仪检测细胞的表面抗原CD14、CD29、 CD34、CD吟4、CD45,检侧细胞的纯度。研究其中一个影响因素时, 控制其它的影响因素相同。并以选定的条件培养、扩增11MSCs。 2人骨.间质干细胞作为骨、软骨组织工程种子细脸的实脸研究 已选定的优化条件体外分离、培养成体bMSCs。同时从引产胎 儿器骨获得骨盆,体外培养从骨位中获得的fMscs.扩增成体bMSCs 及舰SCs,以流式细胞仪检裁成体hMSCs及以SCs的表面抗原。在 特定诱导培养基内体外诱导成体hMSCs及且以SCs向成骨细胞、软骨 细胞分化。以倒置显徽镜、电子显徽镜观察细胞形态。以组织化学 (A工P染色、Ca结节染色)、免疫组织化学(COL-I、OC蛋白)、 RT.PCR(COL一I、OC mRNA)检侧成骨诱导结果。以组织化学(甲 第四军医大学博士学位论文 苯胺蓝染色)、免疫组织化学(COL一11蛋白)、RT一PCR(COL- nmRNA)检测成软骨诱导结果。 3人骨位间质千细胞库建立条件的研究 将传代后的hMSCs以含20%FBS、10%DMSO的完全培养基作 为冻存培养液,采用液氮深低温保存.对冻存1个月、2个月、6个 月、10个月的hMSCs复苏培养,采用37℃快速复温,离心去除伽s0, 于含10%FBS的L一DMEM中培养,苔盼蓝染色侧定细胞存活率,并 绘制生长曲线。扩增培养复苏后的bMSCs,以流式细胞仪鉴定细胞 表型。对扩增后的复苏hMSCs进行成骨和成软骨诱导培养,倒置显 徽镜、扫描电镜、透射电镜观察,细胞化学、免疫组化和RT-PCR检 测染色检测成骨诱导、成软骨诱导后细胞的特异性标志物。 4人骨位间质干细胞的立体成软骨培养及工程化软骨的构建 分离bMSCs,以流式细胞仪鉴定hMSCs,并在体外扩增培养。 将扩增后的hMSCs接种在方形聚经基乙酸(PGA)支架上,并在特 定诱导培养基中将其作成软骨立体定向诱导。以RT一PCR检测诱导 后细胞的n型胶原mRNA的表达。诱导3周后将细胞一支架复合物 植入裸鼠体内继续培养,以构建工程化软骨。分别在植入后6、10 周将植入物取出,采用大体观察,HE、甲苯胺蓝、阿辛兰、Sa示而n一O、 Masson及免疫组化染色鉴定构建的软骨。 5人骨翻间质干细胞作为软骨组织工程种子细自扩增的t化研究 以选定的条件体外扩增bMSCs并向软骨细胞诱导分化。定量研 究骨盆t、单个核细胞数,原代和扩增后hMScs数及纯度,诱导时 间及诱导率,得出构建一定体积的组织工程化软骨所豁骨橄量及所 需扩增、诱导时间。 结果 1在其它条件不变的前提下,密度梯度分离法优于全骨健法,2.5 Xl曲c扩是hMsc:原代培养的适宜接种密度,原代第5天首次换液 第四军医大学博士学位论文 为最佳换液时间,DMEM培养基优于a一MEM培养基,血清C为适 宜的血清,10%为适宜的血清浓度。以所选条件培养的hMSCs可在 体外扩增15代以上,形态保持不变。 2以优化条件扩增培养的hMSCs及舰SCs经诱导培养后,成骨 诱导培养的细胞上清液中ALP的含t高于对照组.成骨及成软骨诱 导的细胞形态均


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