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《第四军医大学》 2004年
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当归多糖的组成分析及其激活腹腔巨噬细胞的免疫机制

杨兴斌  
【摘要】:研究目的:当归为伞形科多年生草本植物,是中医内、外、妇、儿各科常用的主药,其主要功能为补血和血、调经止痛,兼有滋补强壮、扶正固本及活血化瘀之功效。当归的主要成分为多糖、阿魏酸、挥发油等。其中,当归多糖是主要水溶性成分,且具有广泛的生物活性,成为当归药效物质基础的研究热点。但多糖研究正面临着质量控制、作用机理等目前亟待解决的“瓶颈”问题。因为多糖是不同分子量大小的混合物,难于质量控制;此外,多糖是大分子化合物,不能透过细胞膜,在胃肠道几乎不吸收,而多糖经口服、腹腔注射、静脉等途径给药均有较好的药效,这提示,多糖可能作用于细胞膜受体而介导免疫应答。但其激活机制还不清楚,主要是还尚未鉴定是哪种膜受体起关键作用。而Toll样受体4(TLR4)是近年发现的重要内毒素脂多糖(LPS)受体,是机体天然免疫系统的重要组成部分,在识别病原体,启动NF-κB通路,促进NO、TNF-α等细胞因子分泌中起关键作用。最新研究表明,几种细菌多糖可作用于TLR4表面分子而激活巨噬细胞、T细胞和B细胞,认为TLR4可能是该多糖的受体。为此,本文针对当归多糖研究中存在的主要问题,拟集中建立当归多糖组成测定的高效液相色谱(HPLC)质控技术,并以小鼠腹 第四军医大学博士学位论文 腔巨噬细胞的TLR4为当归多糖的候选作用靶点(受体),研究中 药植物当归多糖是否通过TLR4介导腹腔巨噬细胞的激活,揭示 当归多糖的作用机理。 研究方法:以崛县当归根为药材,采用水煮、乙醇沉淀、透析、 反复冻融除蛋白、冷冻干燥等方法制备粗多糖,并经葡聚糖凝胶 柱进一步分离纯化为不同的多糖组分。用IR、UV、元素分析、旋 光度等常规分析方法从不同角度反映多糖的纯度、理化性质等基 本特征。在采用目前较成熟的气相色谱(GC)法测定多糖组成的 实验基础上,通过1一苯基一3一甲基一5一毗咪酮(P MP)柱前衍生化高 效液相色谱法,建立常规紫外检测和C,8柱分离分析多糖组成的新 方法。同时,从BALB/c纯系小鼠分离腹腔巨噬细胞,进行原代 细胞培养;采用过氧化氢(HZO:)和叔丁基过氧化氢(tBOOH) 为活性氧(ROs)实验损伤剂(激活剂),建立巨噬细胞损伤模型, 观察当归多糖对ROS激活的巨噬细胞释放NO的影响及其抗损伤 保护效应。此外,采用M竹、紫外可见分光光度法等方法研究当 归多糖对正常巨噬细胞释放细胞因子等免疫活性的影响,并采用 免疫组化、Rl’- PCR等技术研究当归多糖对巨噬细胞诱导型一氧化 氮合酶(iNOS)和TLR4基因表达的影响,揭示多糖作用机理。 实验结果:当归经水提、醇沉、反复冻融除蛋白等方法,成 功地实现多糖的分离纯化;制备的粗多糖CAP呈白色,提取率达 10%以上;为实现均一、药效稳定的目的,CAP进一步经 Sepha卿l一5 400凝胶层析柱(94 X sem)分离纯化为”FI,^PFZ 和APF3三个明显的组分。元素分析、紫外扫描、旋光度测定、分 光光度分析等实验结果表明,该提取工艺得到的当归多糖组分 APFI和妙FZ未发现有蛋白质或核酸等杂质的存在;但CAP及 其组分APF3发现含有少量蛋白质,表明采用本室建立的反复冻融 第四军医大学博士学位论文 除蛋白方法,其除蛋白效果较为理想。药效实验表明,APFI,APFZ 和APF3均有抗氧化损伤、抗肿瘤、激活巨噬细胞等功效,各组分 的生物活性顺序为APF3APFZAPFI。其中,APF3与APFZ活 性相当,但APF3稳定性较差,药效重复性不理想,这可能与其结 合的蛋白等杂质有关,而以APFZ为当归多糖的代表组分进行药效 评价可得到较稳定和理想的结果。 GC分析结果表明,CAP及其组分APFI、APFZ和APF3的单 糖组成摩尔比各不相同。CAP由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、 甘露糖(Man)、葡萄糖(Gle)、半乳糖(Gal)组成,其摩尔比为 1.00:2.72:0.72:4.00:2.32:APFI由Rha、Ara、Gle、Gal组成, 其摩尔比为1.00:2.27:7.80:2.69;APFZ由Rha、Aia、Man、Gle、 Gal组成,其摩尔比为1 .00:5.29:3.66:9.11: 5.17:APF3由助a、 Ara、Man、Gle、Gal组成,其摩尔比为1 .00:4.54:2.98:1 1.09:7.45。 采用PMP柱前衍生化HPLC法,首次成功地实现当归多糖的 单糖组成分析;并建立了当归多糖水解样品及其PMP衍生化样品 的制备优化工艺。本样品制备方法无任何干燥过程,而是将多糖 水解液直接用NaOH中和(约中性),而后溶液直接进行PMP衍 生化,氯仿萃取后的水层溶液进样分析。该方法避免了传统多糖 水解产物的干燥以及PMP衍生化溶液再次干燥的复杂烦琐过程。 这对于发展多糖的定性定量在线分析技术有重要的理论和实际意 义。该制备方法具有如下特点:①简化工艺、避免糖的干燥损失; ②改进后的样品制备工艺,节约2/3的时间,而对多糖的组成测 定无影响;③可用于多糖和单糖的在线大批量定性定量分析监 测。HPLC分析结果表明,CAP由甘露糖(Man)、鼠李糖(灿a)、 葡糖糖醛酸(GleUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Gla)、半 乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)七种单糖组成,其摩尔比为0.57:1.00: 0 .13:3 .06:8.16:7.17:12.69;APFI由Rha、GalUA、Gle、Gal、 Ara五种单糖组成,其摩尔比为1.00:2.65:2.02:3.45:10.64;’APFZ 第四军医大学博士学位论文 由Man、
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R285

【引证文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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7 卢苏燕;HIV破坏免疫系统机制被揭示[N];医药经济报;2007年
8 李东方;咖喱可预防早老性痴呆[N];中国中医药报;2007年
9 本报记者 杨珂;了解我们的体内“卫士”——免疫系统[N];中国消费者报;2001年
10 广东省农科院 黄忠 博士;猪群健康生产要靠什么?[N];中国畜牧兽医报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 杨兴斌;当归多糖的组成分析及其激活腹腔巨噬细胞的免疫机制[D];第四军医大学;2004年
2 黄俊龙;去甲肾上腺素通过toll样受体4促进巨噬细胞炎症因子的分泌[D];第二军医大学;2008年
3 章宏;1.人巨噬细胞金属弹性蛋白酶在胃癌细胞及胃癌组织中的表达及临床意义 2.胃癌和结肠癌患者二氢嘧啶脱氢酶基因多态性与5-FU代谢及临床意义探索[D];浙江大学;2006年
4 王玉珍;溶酶体相关的小G蛋白Rab7b负向调节巨噬细胞Toll样受体信号转导的研究[D];浙江大学;2006年
5 杨洋;DcR3干预肺纤维化动物模型及其转染人成纤维细胞的实验研究[D];吉林大学;2009年
6 冯旭阳;天然属性抗氧化低密度脂蛋白IgM亚类抗体在动脉粥样硬化中的作用及机制研究[D];第四军医大学;2009年
7 张伟;严重胸部创伤肺泡及间质巨噬细胞TLR4表达差异及意义[D];第三军医大学;2004年
8 余其振;氧化低密度脂蛋白对巨噬细胞TOLL样受体4的表达效应及其机制的研究[D];华中科技大学;2006年
9 马翠卿;GAS下调巨噬细胞炎症因子的作用及机制研究[D];河北医科大学;2011年
10 鞠瑞;羧胺三唑的抗癌新机制抑制肿瘤相关巨噬细胞中促炎细胞因子的释放[D];北京协和医学院;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 余琦琦;壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究[D];浙江大学;2002年
2 冯洁;壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究[D];浙江大学;2004年
3 田美玉;复发性口腔溃疡粘膜组织中肥大细胞和巨噬细胞的研究[D];山西医科大学;2004年
4 龙飞;糖皮质激素对巨噬细胞快速非基因组作用的研究[D];青岛大学;2005年
5 徐启华;玉屏风散转化液对小鼠相关免疫功能影响的研究[D];黑龙江中医药大学;2005年
6 武多娇;炎症细胞在自发性高血压大鼠心肌纤维化中的作用及苯那普利的干预研究[D];福建医科大学;2005年
7 徐宗华;胸苷磷酸化酶在人脑胶质瘤中的表达、分布及临床意义[D];四川大学;2005年
8 梅智谋;巨噬细胞与血管内皮生长因子在平滑肌肿瘤的表达及意义[D];武汉大学;2005年
9 杨维娜;子宫内膜异位症中单核—巨噬细胞分泌白介素-1α、β和干扰素-γ水平的研究[D];天津医科大学;2006年
10 李永军;糖基化终产物对巨噬细胞MMP-9表达与活性的影响及其机制的初步研究[D];中国医科大学;2006年
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