收藏本站
《第四军医大学》 2004年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

异种同源钙激活Cl~-通道DNA疫苗对小鼠哮喘模型的防治作用

宋立强  
【摘要】:【研究背景】支气管哮喘(哮喘)是一个严重危害人类健康的疾病,目前尚缺少有效的防治方法。哮喘的发病机制复杂,涉及多种效应细胞及其分泌的炎症介质。气道上皮细胞就是其中具有重要作用的效应细胞之一,它位于外界刺激与机体内环境接触的第一环节,在哮喘中处于持续损伤与异常修复的状态,能够分泌多种炎症介质,影响周围组织及炎性细胞的结构与功能,被认为是哮喘发生的始动部位之一。近年的研究表明,上皮中杯状细胞特有的一种钙激活Cl~-通道(CLCA)是上皮杯状细胞参与哮喘发生的主要功能单位,阻断CLCA是防治哮喘具有潜在前景的措施。这种功能独特的CLCA已知基因序列有:人hCLCA1、小鼠mCLCA3。以CLCA为作用靶位的哮喘防治疫苗尚无研究。 【目的】1、利用hCLCA1和mCLCA3的异种同源性,构建人源hCLCA1 DNA疫苗,肌注法接种给小鼠,试图突破小鼠自我的免疫耐受屏障,诱导其产生针对自身mCLCA3胞外肽段的交叉抗体,以期达到阻断气道mCLCA3通透活性、防治哮喘发生的目的。2、利用小鼠在体哮喘模型、杯状细胞体外培养细胞模型,初步探讨该疫苗防治哮喘效应的机制。 【方法】1、将测序鉴定正确的hCLCA1基因亚克隆入分泌型真核表达载体pSecTag2-B,将重组质粒pSecTag2-B/hCLCA1肌注法分次接种给BALB/c小鼠,留取血清,并观察小鼠的生命体征。PCR法扩增mCLCA3的N端、中间和C端三个胞外肽段(ED)基因,构建pRSET-A/N-ED、 第四军医大学博士学位论文 pRSET-AjC一ED和pGEX一4T-l舰一ED重组质粒,并在E.coli BLZI(DE3) 细胞中表达与纯化三个ED。采用EuSA和Westem blotting法检测免疫 血清抗体对ED的亲合力。2、对DNA疫苗组小鼠制备OVA致敏哮喘 模型,检测气道压力峰值一时间指数(APTI)、支气管/肺泡灌洗液 (BALF)中炎性细胞数量,PAS特染观察小支气管杯状细胞数量及 Rl斗PCR法检测肺组织中粘蛋白MUCSAC mRNA水平,免疫组化和 RT.PCR法检测GM一CSF的蛋白与mRNA水平。设立空载体组、哮喘 组和正常组为对照。3、建立稳定表达hCLCAI的NCI一H292/h CLCAI 细胞系,观察细胞的生物活性,以及受到正常组小鼠血清、DNA疫苗 组小鼠血清干预时MUCSAC、GM一CSF的蛋白和mRNA水平。 【结果】 一、hCLCAI DNA疫苗的构建及其免疫学特性的研究结果 1.将获蹭的peDNA3 .1(+)爪CLCAI和peDNA3.l。)/mCLCA3质粒进行 酶切和测序鉴定,结果显示hCLCAI和mCLCA3基因分别与GeneBank 中登录的N0.AF039400和NO.NM一017474一致。成功构建 p跳叮认酥一B爪CLCAI重组质粒后,肌注法接种小鼠并留取不同时间点免 疫血清。 2.扩增出mCLCA3的三个ED基因并在原核细胞表达。SDS一队GE检 测结果显示,Mr xl护为25 .21、 33.94和29.31的条带分别与6His一N一ED、 GST-M‘ED和6His一C一ED对应,其主要以包涵体形式存在,初步纯化。 3.定量和定性检测证实免疫血清与mCLCA3三个ED均有着特异的结 合特性。其中血清抗体与6His一N一ED和6His一C一ED的结合滴度高于 GST.M一D。随着接种时间延长,抗体滴度均呈现出升高趋势。 4.接种DNA疫苗小鼠的生活质量良好,队S特染显示肠道的杯状细 胞数量与合成粘蛋白功能无明显异常。 二、hCLCAI DNA疫苗对小鼠哮喘模型防治作用的研究结果 1.与正常组小鼠相比,哮喘组、空载体组和DNA疫苗组小鼠的平均 APTI值、BALF中嗜酸性粒细胞数量均明显增高,但是DNA疫苗组明 第四军医大学博士学位论文 显低于哮喘组与空载体组,后两组之间没有显著差异。 2.队S特染显示哮喘组、空载体组小支气管上皮出现大量簇状或散在 分布的杯状细胞,并在管腔中出现着色的粘液物质;同时肺组织 MUCSAC mRNA水平显著升高。而DNA疫苗组的上述现象均明显减 轻。 3.DNA疫苗组肺组织的GM一CSF蛋白和mRNA水平均明显低于哮喘 组和空载体组。同一部位小支气管切片的PAS和免疫组化染色结果均 提示,哮喘上皮杯状细胞能够合成GM一CSF。 三、hCLCA 1 DNA疫苗防治哮喘机制的初步研究结果 1.构建真核表达质粒pIRESZ一EGFp爪CLC^l并稳定转染Nel一H292 细胞,获得稳定表达hCLCAI的NCI一H292/h CLCAI细胞系。采用DNA 疫苗组小鼠免疫血清进行Westem bfotting法鉴定。 2.超微结构观察、M竹法和细胞周期检测均显示,NCI一H292小CLCAI 细胞的增殖及合成活性强于亲本细胞。免疫血清能有效抑制这种活性变 化。 3.NCI一H292/h CLCAI细胞的MUCSAC、GM一CSF的蛋白与mRNA 水平均高于亲本细胞,免疫血清能明显抑制这种升高。 【结论】 1.首次证实人源hCLCAI DNA疫苗能够有效诱导小鼠产生可结合自 身mCLCA3三个ED的交叉抗体。 2.hCLCAI DNA疫苗的生物安全性良好,无毒副作用。 3.hCLCAI DNA疫苗在一定程度上抑制了小鼠哮喘模型气道高反应 性、气道勃液高分泌等两种主要症状的发生。其机制是通过交叉抗体阻 断mCLCA3,从而减轻气道局部嗜酸性粒细胞聚集、降低气道上皮及 杯状细胞产生MUCSAC和GM一CSF。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R562.25

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吴春利;程小雯;吕星;房师松;王昕;;A型流感病毒M基因DNA疫苗载体构建及免疫性研究[J];中国热带医学;2011年07期
2 齐文娟;方强;;寄生虫病DNA疫苗研究进展[J];中国血吸虫病防治杂志;2011年03期
3 李晨晨;于继云;姜敏;涂亦娴;马晓林;张富春;;草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3的构建表达及其免疫不育的研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年09期
4 邓璐;邹墨;刘艳;罗恩杰;;DNA疫苗的转运途径及其安全性研究进展[J];医学动物防制;2011年08期
5 张亮;阎瑾琦;王越;肖毅;高昆;董金凯;王博;于继云;;可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达[J];南方医科大学学报;2011年06期
6 胡方靖;武军驻;;pIHsp65GM的构建及其对结核杆菌感染小鼠的保护[J];免疫学杂志;2011年08期
7 周方杰;陈志武;;硫化氢介导的大鼠大脑中动脉的内皮源性超极化因子反应[J];安徽医科大学学报;2011年08期
8 张阳;王英丽;;MUC1基因疫苗对乳腺肿瘤抑制的实验研究[J];中国妇幼保健;2011年21期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 宋立强;戚好文;李妍;王吉村;张乐宁;;异种同源钙激活Cl~-通道DNA疫苗对哮喘小鼠模型的预防作用[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
2 居巍;刘君炎;;结核杆菌HSP65佐剂DNA疫苗的实验研究[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
3 姜秀云;何昭阳;;活体电穿孔法导入DNA:牛结核病免疫接种新技术[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
4 靳彦文;钟辉;马清钧;;恶性疟原虫DNA疫苗的安全性研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
5 田洁;刘君炎;;ConA与结核杆菌HSP65DNA疫苗联合应用的研究[A];湖北省暨武汉市免疫学会第八届学术会议论文集[C];2003年
6 熊金虎;赵民;邱小萍;伍欣星;;人乳头瘤病毒嵌合型DNA疫苗的构建及其免疫效应研究[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第七届第十四次学术年会论文摘要集[C];2003年
7 江云波;方六荣;肖少波;牛传双;张辉;陈焕春;;修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的免疫反应[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
8 吴长有;;DNA疫苗与免疫记忆[A];2005全国第二届核酸疫苗研讨会论文集[C];2005年
9 崔保安;魏战勇;杨明凡;张素梅;;DNA疫苗免疫佐剂的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(上)[C];2003年
10 杨慧兰;葛梦林;杨太成;刘荣卿;;单纯疱疹病毒gD2 DNA疫苗免疫动物诱导的细胞免疫应答[A];2003中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 蒋明 周汉桥;DNA疫苗研究取得突破[N];健康报;2005年
2 林明贵 金关甫;DNA疫苗 战胜结核的希望[N];健康报;2003年
3 ;防治早老性痴呆DNA疫苗问世[N];新华每日电讯;2004年
4 ;DNA疫苗“饿”杀小鼠肿瘤[N];医药经济报;2003年
5 陈勇;西尼罗病毒DNA疫苗开始临床试验[N];健康报;2005年
6 梅子;期待从今天开始[N];医药经济报;2001年
7 刘恕;艾滋病疫苗离我们还有多远[N];科技日报;2005年
8 本报记者 王玲 柯玲;中国艾滋病疫苗与时间赛跑[N];经济日报;2005年
9 曲国斌;征服艾滋病不是梦[N];健康报;2001年
10 何雁;何大一:倾心祖国艾滋病防治[N];人民日报海外版;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 宋立强;异种同源钙激活Cl~-通道DNA疫苗对小鼠哮喘模型的防治作用[D];第四军医大学;2004年
2 张洪英;口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性和安全性研究[D];第二军医大学;2003年
3 张静;轮状病毒分子流行病学调查及脂质体DNA疫苗研究[D];重庆医科大学;2002年
4 王涛;嗜肺军团菌mip基因DNA疫苗初步研究[D];四川大学;2004年
5 时阳;MAGE-1与IL-18共表达DNA疫苗的构建及体内外功能验证[D];吉林大学;2004年
6 郭瀛军;猪带绦虫囊虫病DNA疫苗的中试及免疫效力研究[D];第二军医大学;2004年
7 张梦寒;汉城病毒M片段和汉滩病毒部分S片段核酸疫苗pEGFP-M-S的构建及基因免疫研究[D];苏州大学;2005年
8 焦解歌;猪Endoglin DNA疫苗诱导抗肿瘤血管生成机理研究[D];中南大学;2005年
9 郭慧琛;O型口蹄疫病毒多基因DNA疫苗的研制[D];中国农业科学院;2004年
10 张含;口服DNA疫苗防治实验性脉络膜血管新生[D];中国医科大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张恒;鸡贫血病毒DNA疫苗的研究[D];山东师范大学;2003年
2 曾政;布鲁氏菌新型疫苗的构建及其免疫原性研究[D];西北农林科技大学;2004年
3 杨帆;鸡传染性支气管炎病毒分离株IBV_(WHNJ)M基因DNA疫苗研究[D];四川农业大学;2004年
4 杨璇;癌胚抗原DNA疫苗的构建及佐剂对其免疫效应的影响[D];郑州大学;2002年
5 黄力;口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性[D];河北医科大学;2004年
6 张强哲;H5亚型禽流感病毒HA DNA疫苗的研究[D];西北农林科技大学;2003年
7 蒋英;白细胞介素12对结核病DNA疫苗效应的增强作用[D];重庆医科大学;2003年
8 蒋文明;以减毒沙门氏菌为载体传递猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA疫苗的口服免疫应答[D];南京农业大学;2004年
9 贾文影;新孢子虫PO基因的真核表达及DNA疫苗的初步研究[D];延边大学;2010年
10 罗彬;犬瘟热病毒H基因克隆分析及DNA疫苗研究[D];中国农业科学院;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026